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PCR反应程序 1．常规程序????将 PCR 反应所需的成分配置完后，在 PCR 仪上于 94-96℃ 预加热几十秒至几分钟，使模板 DNA 充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于 94℃ 保持 30 秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般 50-60℃ 之间），一般保持??30 秒钟，使引物与模板充分退火；在 72℃ 保持 1 分钟（扩增 1kb 片段），使引物在模板上延伸，合成 DNA ，完成一个循环。重复这样的循环 25～35 次，使扩增的 DNA 片段大量累积。最后，在 72℃ 保持 3-7min ，使产物延伸完整， 4℃ 保存。? 2．复性（退火）和延伸温度????复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定。延伸温度绝大多数设定为 72℃ 。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR 。? 3．反应时间????变性步骤一般使用 30 秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有 30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。? 4．循环次数????循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为 104～105 数量级时，循环数通常为 25～35 次。??????平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低， dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。? 5．PCR 反应液的配制????PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入 DNA 聚合酶。早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。????对于使用具 3’-5’ 外切活性的高温 DNA 聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A 管含模板、引物和 dNTP ，以及调整体积的 H2O ， B 管含缓冲液、DNA 聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。????按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决这一问题。将 dNTP 、缓冲液， Mg2+和 primer 先配制好，然后加入一粒蜡珠（如 Ampli Wax PCR Qam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和 DNA 聚合酶等剩余成分。只有当 PCR 反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。 PCR技术的基本原理 　　PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 　　PCR的反应动力学　 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DN***段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DN***段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 　　PCR扩增产物 　可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片