第十五章：酵母菌基因工程选编.ppt

第十五章 酵母菌基因工程;酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。共有56属和500多个种组成。酵母是最成熟的真核生物表达系统。;;;发展历程;1981，Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。 1983，我国首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。 1996，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。;酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统;易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；;培养条件简单，容易进行高密度发酵； 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。;缺陷在于：;酵母基因工程的发展现状;酿酒酵母的自身改造：;将β-葡聚糖酶基因导入酿酒酵母（可有效降解麦芽汁中的β-葡聚糖，改善啤酒的过滤效率）;将ATP硫酸化酶和腺苷酸硫酸激酶在酿酒酵母体内表达（促进SO2的生成，维持啤酒风味的稳定）;将人血清清蛋白（HAS）基因转化到酿酒酵母（生产出富含HAS的啤酒新品种）;酵母表达异源蛋白;通过开发高效的启动子提高和控制外源基因的转录水平。 提高表达载体在细胞中的稳定性。 通过多次同源重组以及rDNA介导的整合两种方式提高表达基因在细胞中的拷贝数。;表达质量：除表达水平外，外源基因表达质量的好坏也直接关系到酵母表达系统的应用价值。;酵母基因工程的发展趋势;利用酵母基因工程筛选更多的制药； 改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本； 酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注。;广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌 ;广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌;提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌;利用经典诱变技术筛选分离酿酒酵母的核突变株或细胞质突变株，可以提高重组异源蛋白在酵母菌中的合成产率。然而，有些在表型上能提高某种特定异源蛋白表达的突变株未必具有促进其它外源基因表达的能力，因为提高一种特定异源蛋白合成和分泌的影响因素极其复杂，其中包括表达产物本身的生物化学和生物物理特性，只有那些能促进任何外源基因分泌表达的基因型稳定突变株，才能用作理想的基因工程受体细胞。 ;许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。;;酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修饰和加工系统对来自高等动物和人的异源蛋白活性表达是极为有利的，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。;突变类型 生物效应 mnn 甘露糖生物合成缺陷型 alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 och 外侧糖链添加缺陷型;含有mnn9突变的酵母菌细胞缺少能聚合外侧糖链的a-1,6-甘露糖基转移酶活性，而och1突变株则不能产生膜结合型的甘露糖基转移酶。尽管其它类型的突变株尚未进行有效的鉴定，但它们却能使异源蛋白在天门冬酰胺侧链上进行有限度的糖基化作用，基本上杜绝了糖基外链无节制延长的超糖基化副反应。;减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 ;;第一类基因含有多个泛蛋白因子编码重复序列，各重复序列头尾相连形成多拷贝结构；;第二类基因为单一泛蛋白因子编码序列与另一个不相关的多肽编码序列的融合基因，后者称为羧基延伸蛋白（CEP），它也有两种大小不同的序列，其中CEP52由52个氨基酸残基组成，而CEP76-80则由76-80个氨基酸残基组成。 ;在酵母菌中共有四个基因编码泛蛋白因子：;UBI1、UBI2和UBI3基因均能在酵母菌对数生长期内表达，当菌体进入稳定期后便自动关闭，UBI4的表达时序与前三种基因恰好相反，这说明四种基因编码产物的生物学功能并不完全相同。 ;第一类基因包括UBC4、UBC5和UBC7，其编码产物只拥有相应的保守结构域，多肽序列的其它区域并没有明显的同源性，这些蛋白形成泛蛋白-靶蛋白共价接合物的活性严格依赖于E3蛋白的存在；;第二类基因包括UBC1、UBC2、UBC3和UBC6，它们的表达产物具有天然的C端延伸活性，不需要E2蛋白的参与便可进行泛蛋白的接合反应。 ;如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种降解作用减少到最低程度：;第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速被转位到分泌器中，即可有效避免降解作用；;第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的启动子