PNPTK融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究的论文.docVIP

　　PNPTK融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究的论文 作者：周俊立,蔡晓坤 杨翌 周卫平,王德全 姚振江 【摘要】 目的 分析pnptk融合自杀基因系统对hepg2肝癌细胞的杀伤作用及其对肝癌细胞的杀伤机制。方法 利用重组pcr定点诱变法制备pnptk融合基因，将其插入真核表达载体pcdna3.0中，构建融合基因表达载体pcdna3.0/pnptk，经酶切、pcr及测序鉴定重组体，g418筛选获得稳定转染了pcdna3.0/pnptk的抗性细胞克隆。rtpcr和tt法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果 融合基因片段pnptk正确插入了pcdna3.0载体中，pcdna3.0/pnptk在肝癌细胞株hepg2中实现了表达。细胞抗性克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下，pcdna3.0/pnptk对肝癌细胞产生了良好的旁观者效应。结论 具有双自杀基因功能的表达载体pcdna3.0/pnptk对肝癌细胞hepg2有???良好的杀伤作用，有望将其应用于肝癌体内治疗。 【关键词】 pnptk融合基因; 肝癌;基因治疗 　abstract:objective to investigate the cytotoxic effects of a pnptk chimeric gene on the basis of pnp suicide gene on hepg2 hepatoma cells and explore the potential mechanism of their killing effects.methods a fusion suicide gene,pnptk,utagenesis technique. and then it eric gene,pcdna3.0/pnptk. the rebinant e,pcr and sequencing. then it emediated method. the cellular clone stably transfected ethod. the groined by trypan blue exclusion test. the sensitivity of the cell clone to its corresponding prodrugs and the caused bystander effects tt method.results the pnptk fusion gene ed. the cellular clone epdr and gcv. it onstrated that the bystander effects derived from pcdna3.0/pnptk after the synergetic treatment of mepdr and gcv ighty.conclusion the killing effects of the bifunctional suicide gene vector,pcdna3.0/pnptk,on hepatoma cells are satisfactory. it ising to apply pcdna3.0/pnptk to gene therapy for hepatoma in vivo. 　　key eric gene;hepatoma;gene therapy 　　单自杀基因系统治疗肿瘤易引起肿瘤耐药性，又存在着对特定细胞类型的依赖性。.融合自杀基因产物兼具两种自杀基因的功能，使两种自杀基因产生协同作用，从而既克服了细胞类型依赖性，又减少了肿瘤细胞对药物的耐药性，提高了这一疗法的实用性。本实验将一种新型自杀基因系统——大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)/6甲基嘌呤脱氧核糖核苷(mepdr)系统[1]与目前已广泛应用的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(mepdr)/gcv[2]系统相结合，构建融合自杀基因表达载体pcdna3.0/pnptk，筛选出稳定表达pnptk基因的抗性细胞克隆，经旁观者效应证实融合自杀基因pnptk对于肝癌细胞的杀伤作用。结果显示，在两种前药协同作用的情况下，pcdna3.0/pnptk对肝癌细胞显示出良好的杀伤作用。 　　1 材料 　　1.1 细胞株 肝癌细胞株hepg2购自武汉中国典型培养物保藏中心(cctcc)。 　　1.2 质粒与菌株 真核表达载体pcdna3.0购自invitrogen公司，携pnp基因质粒ptyrpnp2美国pittsburgh 大学david barlett教授惠赠，含mepdr基因载体pⅱ1