丹皮酚联合阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用的论文.docVIP

　　丹皮酚联合阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用的论文 【摘要】 目的 探讨丹皮酚联合阿霉素对hepg2细胞株的增殖抑制作用。方法 采用mtt法测定丹皮酚、阿霉素及丹皮酚联合阿霉素体外对hepg2细胞的增殖抑制率；采用两药相互作用指数评价两药相互作用性质；流式细胞仪检测细胞凋亡；原位细胞凋亡检测法观察细胞凋亡形态学变化；g/l分别与阿霉素在0.16、0.31mg/l联合应用时协同作用最为显著（cdilt;0.7）。流式细胞仪检测联合用药组凋亡率(37%)明显高于对照组和单独用药组。tunel染色可见典型的凋亡形态学特征。a, hcc）是我国常见的恶性肿瘤之一，大多数患者在确诊时已属中晚期，失去手术机会。阿霉素是肝癌化疗的一线用药，然而其有效率低于20%,并且血液系统毒性和胃肠道反应十分明显[1]。.因此努力寻找有效的药物和最优化的治疗方法是当前的研究重点。 丹皮酚（paeonol，pae）又称牡丹酚，是毛莨科植物牡丹根皮和萝摩科植物徐长卿干燥根或全草的主要有效成分。研究表明，丹皮酚不仅对多种肿瘤细胞株均有一定的增殖抑制作用，而且能增强顺铂对人肝癌细胞hepg2和smmc7721的增殖抑制作用[24]。 本研究通过观察丹皮酚联合阿霉素对hepg2细胞株的增殖抑制作用，并探讨其可能的机制，为肝癌的临床治疗提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 药品及试剂 pae 注射液购于上海第一制药厂；注射用盐酸多柔比星（doxorubicin, dox）购自深圳万乐药业有限公司；dmem培养粉、胎牛血清、胰蛋白酶购于美国hyclone 公司；四甲基偶氮唑盐（mtt）和鼠抗人bax、bcl2购于美国sigma公司；tunel购于promegar公司；bca protein assay kit 由pierce公司提供。 1.2 主要仪器设备 nacpo6100 co2培养箱(美国杜邦公司产品)；yj1450 型医学净化工作台(苏州净化设备公司)；倒置式显微镜(olympus)；el301 strip reader（酶标仪）(美国bem培养液中，置37℃、5%co2的培养箱，取对数生长期细胞用于实验。 1.4.2 肿瘤细胞体外增殖抑制实验[5] 采用mtt法，设实验组、细胞对照组和空白对照组。实验组每孔分别加入200μl 培养液稀释的药物（pae 的终浓度为7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00mg/l，dox的终浓度为0.16、0.31、0.63、1.25、2.50mg / l，两药合用的比例为1∶1 方案），细胞对照组和空白对照组只加入等量的培养液，在酶标仪上用570nm 测定吸光值（a）。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率(ir)=（1-实验组a值/细胞对照组a值）×100%。以药物浓度为横轴，抑制率为纵轴，绘出生长抑制曲线。以药物浓度的对数与抑制率进行直线回归并求出ic50。 1.4.3 药物联合作用评价[6] 采用两药相互作用指数（coefficient of drug interaction，cdi）评价两药相互作用性质，cdi按下列公式计算：cdi=ab/（a×b）。根据活细胞数（吸光值）进行计算，ab为两药联合组与对照组吸光值的比值；a或b是各药物单独使用组与对照组吸光值的比值。当cdilt;1时两药作用性质为协同；当cdilt;0.7时，协同作用非常显著；cdi=1则两药作用性质为相加；cdigt;1则两药作用性质为拮抗。 1.4.4 流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的变化 将未处理及药物处理的肝癌细胞收集到试管中（细胞数5×105～ 1×106），1 200r/min离心10min，弃上清，用pbs漂洗2遍，按dnaprepreagents kit说明书操作，依次加入膜穿孔剂、溴化乙啶(propidium iodide, pi )和rna酶染色，室温避光放置30min，过400目筛网，上流式细胞仪，激发波长488nm测定细胞周期及细胞凋亡率。 1.4.5 原位细胞凋亡检测(tunel) 将细胞接种于6孔板中（含多聚赖氨酸处理过的盖玻片），置37℃、5%co2的培养箱中培养过夜，药物作用48h后取出细胞爬片。4%多聚甲醛固定25min后，按tunel说明书操作，dab 显色，对比染色，脱水透明后封片观察。实验同时设阳性和阴性对照，普通光镜下观察，随机选取5个高倍视野，计数1 000个细胞，计算阳性细胞数占肿瘤细胞的百分比值,作为凋亡指数(apoptosis index, ai)。 1.4.6 mol/l nacl，1% np40，0.5% deoxycholic acid，0.1% sds，2mmol/l edta，50mmol/