胚胎冷冻保存选编.ppt

冷 冻 保 存 技 术;;胚胎保存分为 1.短期临时保存，动物早期胚胎在0～4℃条件下暂时停止发育（可逆），因此胚胎可以在0～4℃低温情况下保存2～3d。 2.长期冷冻保存，将胚胎贮存在－196℃超低温下长期保存的方法。这是20世记70年代试验成功的一项新技术，是胚胎移植技术的重大突破。;精子的保存;卵细胞冷冻保存;胚胎冷冻保存的意义;⑴ 渗透性：甘油、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）和DMSO等，防止溶质效应。 ⑵ 非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等，降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形成。 基础液： mPBS（改良）、 TCM-199、PBS、HEPES等，最常用mPBS。 ;玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段，不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 　　　　即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能形成，由液态变为透明半固态的现象。 玻璃化溶液（VS）： 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。 细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜，所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。 　　　　上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。; ⑴ 结晶变化： 温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外液形成。温度、冰晶和外液的溶质浓度，迫使胚胎内部的水不断外流，胚胎内部溶质浓度增加。 ⑵ 溶质效应： 降温速度太慢，胚胎内水充分外流，溶质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和胞质内的一些其他功能蛋白变性，造成对胚胎的不可逆损害。 ⑶ 机械效应： 降温速度过快，胚胎内部的水来不及溢出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶，从而对胚胎造成致命的机械损伤。 ;⑴ 常规冷冻法：“植冰”后控制降温速度，避免过快以免胚胎内部形成大块冰晶；避免过慢，以免胚胎过分脱水而产生溶质效应。 ⑵ 超速冷冻法：非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。 ⑶ 玻璃化冷冻法：应用高浓度防冻剂，使胚胎内外液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近，控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成玻璃体，直接投入液氮保存。 ;历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功； 　　　　1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并产下后代。 操作流程： （1）抗冻液中平衡：室温下（20～25℃），在含有1～2摩尔∕升抗冻剂的磷酸缓冲液（PBS）中，胚胎经10分钟平衡，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。;（2）植冰（诱发结冰）： 植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹住塑料细管上端（棉栓端），使抗冻液迅速通过－6℃左右冰点，强制性地使细胞外液形成冰晶，称之为植冰。 目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰迅速冻结，以防胚胎细胞内部产生冰晶，给胚胎造成物理性的损伤，致使胚胎死亡。 　　　将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫升塑料细管内封口后进行冷却。当温度降至－6℃左右时，用上述方法诱发结冰。;（4）解冻：贮存在液氮中的塑料细管取出后，迅速浸入室温或37℃水浴中解冻。 （5）除去抗冻剂： 原因： 解冻后的胚胎，细胞内部抗冻剂浓度较高，对胚胎有毒害作用；此外，若直接移入等渗生理溶液中，水分会伸入细胞内引起膨胀，使细胞受损伤。 抗冻液：蔗糖溶液； 操作：解冻后胚胎由浓度高的抗冻液中移向浓度低的抗冻液，进行梯度稀释；即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中，再移入低渗蔗糖溶液中，在脱水的同时脱出抗冻剂，而后移入等渗生理溶液中洗净，待胚胎基本复原后进行移植或继续培养。;（3）自动降温仪中缓慢降温：植冰后的细管按一定速度缓慢降温。 以0.33℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮； 以1.0℃／分钟的速度降至－80℃时投入液氮； 以0.5℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮。 原理：植冰后使细胞外液浓度相对增高，促使细胞内部水分充分脱出，因此缓慢降温是非常必要的。由于脱水使细胞内部充分收缩，同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏性增大，这时投入液氮中，由于过冷抑制冰晶形成。 ; 从培养液中吸取胚胎，并放置在冷冻液中: 1.5M 乙二醇 + 蔗糖 + PBS + AA + FCS 装入细管 (编号预先准备好) 放入冷冻容器 -6.0℃ Seeding ice 每分钟降低 0.5℃ ，一直到-30℃为止 放入液氮容器;玻璃化的概念：是一