1步脱蜡法在FFPE样本DNA提取中的应用优势.docVIP

一步脱蜡法在FFPE样本DNA提取中的应用优势 什么是FFPE 福尔马林固定石蜡包埋技术（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded, FFPE）是一种组织保存技术。这种技术为了维持细胞核蛋白结构，先用福尔马林固定然后将组织用固体石蜡包埋，以供切片后作组织学诊断或研究使用。 FFPE技术的应用 福尔马林由于可以与蛋白氨基发生不可逆交联，所以对保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性方面均优于其他固定液。因此，FFPE技术长期以来在临床检验、医学科学研究中得到广泛应用，尤其是细胞形态学研究和肿瘤病理学研究。随着这几年分子诊断领域的不断发展，FFPE技术也越来越多的被应用在对肿瘤疾病进行分子诊断。 为什么要脱蜡 如果要对FFPE组织进行分子生物学研究，最首先的就是要进行DNA的提取。 但是固定剂的交联作用对核酸是有害的，福尔马林石蜡和交联作用会妨碍核酸的提取，抑制DNA聚合酶的活性从而影响PCR扩增。除此之外，石蜡阻碍消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶K和组织内蛋白的接触，影响组织消化和DNA释放。所以为了消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，必须在保证不增加外源性PCR抑制因子，并尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底脱蜡。 常用的二甲苯法脱蜡法的过程和问题 目前应用在成熟试剂盒中的脱蜡方法主要是有机溶剂脱蜡法，其中二甲苯脱蜡法由于其脱蜡彻底的特性，被最广泛的应用在肿瘤研究中。 在二甲苯脱蜡法中，需要将石蜡包埋组织浸泡在二甲苯溶液中进行脱蜡，后面经过两次高温处理，每次各一个小时，分别在56℃和90℃。在此期间结合消化缓冲液和蛋白酶K来消化组织，同时利用梯度乙醇来疏松组织结构、促进消化液渗入并去除组织中痕量的二甲苯和甲醛。 图1 二甲苯脱蜡法基本步骤 虽然二甲苯脱蜡法是目前最主流的脱蜡方法，并且被应用在绝大多数商业试剂盒中，但是它还是有一定的问题：首先，二甲苯是一种有毒的有机试剂，在实验过程中如果身体接触到会有一定程度的危害，所以此实验是有一定风险的；其次，此脱蜡法的实验过程很繁琐，脱蜡的步骤耗时至少是耗时3小时以上，加上提取的步骤整个实验4小时左右，而且涉及到的试剂种类较多，容易出错。所以各个公司都在积极研发更高效、安全、简易的解决方案来取代二甲苯脱蜡。 一步脱蜡法的改进和优势 为了简化石蜡包埋组织的脱蜡过程，一种新的一步脱蜡法被研发出来。具体步骤如下图所示，将新型的一步法石蜡裂解液（无毒性）与组织裂解液加入到离心管中并与切片好的石蜡组织样本混合，在60℃和90℃各孵育1小时后管内的液体会分成油层和水层两层从而完成脱蜡，脱蜡后核酸会存在与水层中。 图2 一步脱蜡法基本步骤 相较于传统的二甲苯脱蜡法，这种新的一步法脱蜡法的优势主要体现在下面几个方面： 表1 传统二甲苯脱蜡法与一步脱蜡法的区别 项目传统二甲苯脱蜡法一步法脱蜡法石蜡溶解液类型有毒物质二甲苯使用无毒溶解液分离方式需要离心机离心去除上清液油水分层，无需额外操作脱蜡裂解连接方式脱蜡---风干---加入裂解液裂解组织脱蜡和裂解同步加热进行，节省步骤自动化兼容性无法兼容自动化由于其一步法的特性，无需额外手动操作，非常适合整合到自动化仪器耗费时间3小时2小时 在DNA的提取效果上，下面的实验对比了传统脱蜡法和一步脱蜡法对于大型、中型、和小型样本的提取得率。 大型样本：切片后面积介于2.5-4 mm2、厚度介于5-20 um、体积介于0.0125-0.08 mm3之间的样本。 中型样本：切片后面积介于1.5-2.5 mm2、厚度介于5-20 um、体积介于0.0075-0.05 mm3之间的样本。 小型样本：切片后面积介于0.2-1.5 mm2、厚度介于5-20 um、体积介于0.001-0.03 mm3之间的样本。 图3 传统脱蜡法与一步脱蜡法在提取得率上的区别 结果表明，在大量样本时，两种方法提取得率相当；中量和小量样本时，一步脱蜡法的得率均大于传统脱蜡法。所以一步脱蜡法不仅简化了操作、降低了风险，而且提高了提取效率。 一步脱蜡法如何整合自动化解决方案 在上述的优势中，一步脱蜡法相对于传统二甲苯脱蜡法决定性的优势就是对于自动化的兼容性，一步法的特性使其可以非常简单的整合到磁珠法自动化核酸提取仪上，再一次减少需要人工参与的步骤。只需要将切片好的样本放入预装好的试剂槽中、准备好需要的耗材，开机运行后等待即可，解放了实验人员时间，大大提高了实验效率。 现在，业内很多企业都在利用这种方法开发自动核酸提取仪，例如TIANGEN公司就利用此方法研发了一款石蜡组织一步法DNA提取试剂盒，配合TGuide M16/48 磁珠法自动核酸提取仪可以在3小时内完成石蜡切片组织样本的脱蜡、DNA