紫色非硫细菌GP7基因文库的构建和新酯酶基因的克隆的论文.docVIP

　　紫色非硫细菌GP7基因文库的构建和新酯酶基因的克隆的论文 作者：吴培诚，金小宝，张云光，王卓娅 【摘要】 目的 筛选并克隆具备降解甲氰菊酯农药的新酯酶基因。方法 通过建立紫色非硫细菌gp7的基因文库，用酯酶快速筛选方法获取甲氰菊酯降解基因。结果 从紫色非硫细菌gp7的基因文库中筛选到一个新型酯酶基因序列rhe8。该基因核苷酸序列大小为810 bp，包含 269 个氨基酸残基，其中有 565 bp 序列片段与rhodospirillum centenum sethods to build a gene library of rhodoplanes sp. gp7 and them screen the esterase gene ethod. results a novel esterase gene rhe8 the gene library of rhodoplanes sp. gp7. the gene sequence length ent had 94% homology betent of genome of rhodospirillum centenum sinary testing shoa公司，用n,n二甲基甲酰胺 (dmf) 配成1 mg/ml，分装后4 ℃保存;40%甲氰菊酯乳油购自中山市石岐农药厂;99%甲氰菊酯标准品购自广州化学测试中心;其余试剂均为国产分析纯。 　　lrh22502gb光照培养箱为宏泰医疗器械公司产品，台式离心机hettich universal 320及tgradient 296型pcr仪为biometro公司产品，gel doc 2000凝胶成像系统美国伯乐公司产品。 　　1.3 培养基与培养条件 　　光合细菌(psb)培养基：ms培养基添加0.15%酵母膏，参照 文献 [5]，在psb培养基中添加一定浓度甲氰菊酯作为诱导培养基;固体培养基则添加1.5%琼脂粉。 　　培养条件：采用200 ml三角瓶光照培养，培养温度为34 ℃，光照强度设定为3 000 lx。 　　1.4 基因文库的构建 　　使用诱导培养基光照培养gp7 3 d后，离心收集菌体。使用总dna提取试剂盒按照试剂盒说明书提取其基因组总dna，琼脂糖电泳初步检验纯度及浓度;使用hind ⅲ对基因组进行不完全酶切，回收其3～6 kb酶切片段，然后与已用hind ⅲ酶切并经牛小肠碱性磷酸酶处理过的puc18质粒载体链接，转化到大肠杆菌感受态细胞dh5α内，通过添加amp抗生素的lb培养基初步筛选白色的转化子。 　　1.5 产酶基因克隆的快速测定 　　将1.4节筛选到的转化子用无菌牙签转移到含相应抗生素的lb平板上，对其编号。37 ℃培养18 h后，用含1 mg/ml xcaprylate 的酯酶显色剂递加到菌落上。正置培养基2 h后观察菌体生成蓝色水解圈的情况。挑取带明显蓝色水解圈的菌落待测。 　　1.6 甲氰菊酯降解的效率测定 　　甲氰菊酯含量及降解效率参照 文献 [6]的方法进行。 　　1.7 基因测序和酯酶基因orf同源性比较 　　将阳性转化子交由广州英伟创津公司测序。根据测序结果将序列递交到ncbi genbank上，用ncbi上的软件工具orf finder分析阳性克隆子质粒dna克隆片段序列，进而推测其orf与相应种属的同源性。 　　1.8 酯酶三级结构活性中心预测 　　登陆ncbi网站上的rpsblast (reverse position specific blast) 对phe8的保守区域进行查询，并使用ncbi所提供的三维结构分析软件3d4.1，对酯酶的活性中心进行预测。 　 　2 结果和分析 　　2.1 gp7总dna的提取和纯化 　　将gp7菌种活化后接种到300 ml三角瓶光照培养后，离心收集菌体。按照总dna提取试剂盒程序说明提取其基因组总dna，重溶于50 μl te中。用琼脂糖电泳观察浓度及纯度(见图1)。 　　2.2 gp7总dna的部分酶切及质粒载体的预处理 　　用hind ⅲ对基因组进行不完全酶切，将酶切产物琼脂糖电泳后，回收其3～9 kb片段。同时用hind ⅲ对克隆载体puc18质粒进行完全酶切，用牛小肠碱性磷酸酶处理后，胶回收备用(图1)。 　　将gp7总dna hind ⅲ不完全酶切产物与经同样酶切的puc18质粒用t4连接酶4 ℃连接16 h后，转化到大肠杆菌感受态细胞dh5α中，经预培养后涂布到含amp和xgal的lb平板上，37 ℃培养18 h后，筛选白色转化子。