蛋白酶活化受体1在鼻咽癌中的表达的论文.docVIP

　　蛋白酶活化受体1在鼻咽癌中的表达的论文 摘要】 目的 检测par1在鼻咽癌中的表达,探讨par1在鼻咽癌中表达的意义。方法 免疫组织化学（sp法）检测28例良性鼻咽组织、61例鼻咽癌组织中par1中的表达；采用rtpcr、inke型,癌细胞既膨胀性又浸润性生长的bination混合型。 1.2 药物和试剂 细胞培养试剂购自gibco公司，trizol (invitrogen公司)，逆转录试剂盒(k1621)由武汉晶美公司代理购自fermentas公司。par1鼠抗人单克隆抗体(购自santa cruz biotechology,sc13503)。sp kit、hrp标记羊抗鼠igg购自、dab显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。蛋白裂解液购自pierce公司。 1.3 细胞培养 人鼻咽高分化鳞癌细胞株e1、低分化鳞癌细胞株e2由华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室馈赠。细胞培养选用含有10％新生牛血清的rpmi1640培养液，置于37℃、5％ co2培养箱中培养。待细胞长满培养瓶底部70％～80％时，用含0.02% edta的胰蛋白酶消化传代，取对数生长期用于实验。 1.4 rtpcr检测鼻咽癌细胞株中的par1mrna的表达 用trizol从细胞中提取总rna并逆转录成cdna。设计引物序列(上海生工)，见表1。pcr仪进行相应基因扩增。反应体系为：2.5μl的10×pcr缓冲液(含mg2＋)，2μl cdna，1μl dntps(2.5mmol／l)，上下游引物各0.5μl (10pmol/l)，taq聚合酶0.5μl (5u/l )，用灭菌ddho，补足至25μl。pcr循环参数为：94℃,5min，1个循环；94℃ 50s，59.8℃(par1)／56℃(βactin) 50s，72℃ 50s，35个循环；72℃ 10min终止反应。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳,eb染色,紫外灯观察并照相。 表1 par1和内参βactin基因引物序列 基因引物序列扩增长度par1上游：gtgctgtttgtgtctgtgct598bp下游：cctctgtggtggaagtgtgaβactin上游： ggcggcaacaccatgtaccct202bp下游： aggggccggactcgtcatact 1.5 l（约50ml培养瓶），蛋白提取: 用预冷的pbs 洗细胞3 次, 加入细胞裂解液400μl(900μl memper加入100μl pmsf）裂解细胞，冰盒上刮下细胞,4℃、10000r/min离心10min,收集上清,－20℃保存，bradford比色法测定蛋白浓度定量，调蛋白浓度一致后，行sdspage电泳，转移至硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉37℃封闭1h，与鼠抗人par1一抗（1∶200稀释）4℃孵育过夜，用tbst洗涤3次，每次15min,后加入hrp标记羊抗鼠igg（1∶5000稀释），37℃孵育1h后，用ecl发光试剂，暗室中曝光压片，检测蛋白质表达，胶片扫描保存。 1.6 免疫组织化学（sp法）检测 检测鼻咽癌标本及鼻咽良性标本中par1的蛋白表达并行亚细胞定位。标本处理：收集新鲜鼻咽部活检标本用0.9％生理盐水冲洗后立即置于100ml/l 甲醛固定24h，常规石蜡包埋，切片厚4μm，he染色进行组织学分类。免疫组化sp法,具体步骤参照试剂盒说明书。空白对照以pbs取代一抗，阳性对照为已知阳性片。阳性判断标准：阳性染色呈棕黄色颗粒状，阴性对照无着色。对每例鼻咽部活检标本的par1表达情况与患者临床资料进行分析。 1.7 统计学方法 采用spss10.0软件进行分析，相关性分析采用χ2检验,定量分析采用均数±标准差(±s)表示，行t检验。 2 结果 2.1 两种鼻咽癌细胞株中par1的mrna和蛋白的表达情况及其差异 rtpcr检测到两种细胞株中均存在par1mrna的表达, 两种鼻咽癌细胞株中的表达存在明显差异，其中低分化鳞癌细胞株e2中为高表达，高分化鳞癌细胞株e1为中等表达，见图1。分期早晚相关（plt;0.05），见表2。schmincke型方式生长的鼻咽癌患者中par1的表达明显高于regaud型,有局部淋巴结转移的患者,par1的表达高于无局部淋巴结转移患者，par1的表达率与原发肿瘤范围即t分期（但随t分期的提高表达率增加）无明显相关，但与tnm分期密切相关，分期越晚，par1的表达率越高。此外，男性患者中par1表达率稍高于女性患者，随着年龄的增高，par1的表达率也增高，但差异无统计学意义（pgt;0.05）。 3 讨论 恶性肿瘤侵袭转移是其危害患者生命的主要原因，阻断恶性肿瘤的侵袭转移在恶性肿瘤的治疗中尤为关键。