人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备的论文.docVIP

　　人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备的论文 【摘要】 目的： 利用hek293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素（canstatin）重组腺病毒载体，扩增并纯化重组腺病毒颗粒. 方法： pcr法扩增canstatin全长基因，克隆至pgemt载体，经酶切和测序证实后，亚克隆到穿梭质粒pad5cmv中，获得穿梭质粒pad5cmv/canstatin. 用paci酶单独酶切穿梭质粒pad5cmv/canstatin和腺病毒e3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载体，采用标准的磷酸钙方法共转染hek293细胞. 7~10 d后收获细胞裂解物，在hek293细胞中扩增，病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后，分光光度计检测重组病毒滴度. 结果： 测序证实pegmt/canstatin基因片段与genbank公布的canstatin基因序列一致. 重组腺病毒质粒转染293细胞后24 h观察到绿色荧光, 病毒纯化后制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为2.0×1015pt/l). 结论： 成功???建了表达canstatin基因的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒颗粒，为研究该基因在肿瘤治疗中的作用奠定了基础. 【关键词】 腺病毒载体；血管能抑素；绿色荧光蛋白质类 0引言 自folkman提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”概念以来，肿瘤的抗血管治疗一直受到人们的重视. 近年的研究［1-2］认为，通过上调抑血管生成因子表达或/和下调促血管形成因子的表达，均可抑制肿瘤血管的新生，从而达到抑制肿瘤生长的目的. 目前临床上已有数种抑制新生血管形成的药物用于抗肿瘤治疗，还有许多类似药物处于基础研究之中，并已显示出良好的应用前景［3-4］. 血管能抑素(canstatin)是继血管生成抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)之后，最新发现的来源于血管基底膜ⅳ型胶原的肿瘤血管生成抑制因子. 但利用腺病毒研究其抑制血管的研究报道国内外尚少见. 本研究克隆canstatin基因序列，并利用我们经过改良的腺病毒载体构建方法，构建表达canstatin基因的腺病毒载体，为进一步研究其抗肿瘤作用提供依据. 1材料和方法 1.1材料限制性内切酶：salⅰ，speⅰ，ecorⅰ，claⅰ，xhoⅰ，pacⅰ和t4连接酶(美国fermentas公司); taq dna聚合酶(大连takara公司); dna ladder marker(西安hybigen公司); iptg，xgal(上海sangon公司)；pgemt试剂盒(美国promega公司); 质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海axygen公司); 人cdna文库和宿主菌e.coli dh10b由陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室保存；凝胶图像分析仪(上海复日科技公司); 高速离心机(美国beckman公司); 荧光显微镜及显微荧光摄影系统(德国zeiss公司). 引物序列: forin, 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，72℃ 10 min，其中pcr 共30个循环. 取上述pcr产物20 μl在10 g/l琼脂糖凝胶上电泳，回收700 bp的目的基因. 回收产物以4∶1的比例连接入pgemt载体，22℃过夜. 转化e.coli dh10b大肠杆菌，在amp+lb平板上37℃培养12~14 h，挑取阳性克隆，加入5 ml含amp的lb培养基中37℃摇菌16~18 h. 收集菌液并提取质粒，ecorⅰ酶切，电泳鉴定正确后，选一单克隆送公司测序，命名为pgemt/canstatin. 1.2.2 穿梭质粒载体的构建将pgemt/canstatin质粒dna 用claⅰ和speⅰ双酶切，连接到使用同样酶切的带有绿色荧光蛋白（egfp）荧光的穿梭质粒pad5cmv中，转化dh10b, amp+lb平板筛选、挑取阳性克隆、摇菌16~18 h后提取质粒，xhoⅰ和salⅰ酶切鉴定，构建成转移载体pad5cmv/canstatin. 酶切鉴定后，过柱法中提质粒，200 μl ddh2o溶解并定量. 1.2.3腺病毒的重组、扩增和滴度测定穿梭质粒载体pad5cmv/canstatin 经pacⅰ酶切使其线性化后，与同样用pacⅰ酶切的腺病毒骨架载体采用磷酸钙法共转染hek293细胞. 2 d后用荧光显微镜观察，7～10 d后收集细胞，离心沉淀后，在37℃和-80℃反复冻融3次，4℃, 2500 g离心10 min，收集病毒上清，再次使用上清感染hek293细胞以扩增重组病毒、氯化铯密度梯度离心纯化，分光光度计检测重组病毒含量. 2结果 2.1目的片段的克隆和鉴定pcr扩