第3章工具酶之二(教学).pptVIP

基因工程需要的基本条件;;;用于核酸操作的工具酶;;关于反应体系及注意问题;某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变（P46） Star活性：又称星活性，在甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子、酶与DNA的比例等参数单独或同时发生改变时，会导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称为Star活性（限制酶的第二活性）。能产生第二活性的酶常在酶名称的右上角加一星号“☆”，如EcoR Ⅰ★。 ;几乎所有的限制酶都具有Star活性。 Star活性的影响：导致切割中出现非特异性DNA片段，甚至不能获得预计的DNA片段，影响进一步的DNA连接重组。 排除方法：排除产生Star活性的条件。如降低反应系统中甘油含量，控制pH中性和高盐浓度下进行反应。;反应系统包括：酶、底物、反应缓冲液、合适的反应温度等。 1、底物DNA 限制酶的催化效率与DNA样品纯度、DNA分子构型、识别序列两侧序列长短以及序列碱基甲基化等密切相关。 DNA纯度； DNA分子构型；（线形DNA超螺旋和环形DNA） 识别序列的侧面序列； 位点偏爱； DNA甲基化。;2、限制性核酸内切酶用量 主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品 1酶活性单位（unit或U）：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，60 min内完全切割 1μg λDNA所需的酶活性。 酶活性高的用量少，反之则多。 能被高效切割的DNA样品用酶量少，反之则多。 等量的两种DNA样品，限制酶识别序列密度大的用酶量多，反之则少。;3、限制性核酸内切酶反应缓冲液 包含：氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇(2-Me)、Tris-HCI或Tris-Ac。;4、限制性核酸内切酶反应温度 大多数的最适反应温度是37℃，而少数酶的最适反应温度高于或低于37℃。;附：;5、DNA分子的限制性图谱;II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II 型核酸内切酶的多酶切法注意（教材P48）： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 1、使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。 2、低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0. 1倍体积的5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥; 影响限制性核酸内切酶活性的因素 1.DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等 措施： 加大酶的用量，1μg DNA 用10U 酶 加大反应总体积 延长反应时间;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;附：限制性核酸内切酶类型(参考资料)（P34表2-5） Ⅰ型限制酶 Ⅱ型限制酶 Ⅲ型限制酶;（1）Ⅰ型限制酶（无用） 分子量：30万dal左右 组成：3种亚基 特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。 修饰亚基：具甲基化酶活性。 限制亚基：具核酸内切酶活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。 识别和切割位点：不一致（距识别位点5’一侧数千碱基处随机切割DNA分子）。;（2）Ⅱ型限制酶（十分有用） 分子量：2万～10万dal（较小） 组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。 辅助因子：无需辅助因子，或只需Mg2+。 识别和切割位点：相一致。;（3）Ⅲ型限制酶（无用） 组成：两个亚基 M亚基：负责位点的识别与修饰。 R亚基：具核酸酶的活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM 识别和切割位点：不一致（距识别位点3’??侧约25bp处切割DNA分子）。;二、Ⅱ型限制酶的特性 1、不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列;有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。 如：Sau3A识别 ： GATC BamHⅠ识别 ： GGATCC;Ⅱ类限制酶识别序列特点——回文序列 （旋转对称或二重互补对称）;3、识别序列出现的概率1/4n （n为识别序列所含核苷酸的数目）;稀切酶—— 有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制性核酸内切酶. 在基因操作中使用稀切酶可获得大的片段。 ;;;②平头末端（平端）;同尾酶（isocaudamer） 有些限制性内切酶虽然来源各异，识别序列也各不相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末