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第五章 蛋白质纯化、鉴定及 结构与功能分析-4 杜 芬 Email：fen.du@ 蛋白质功能分析 1. 酵母双杂交； 2. 噬菌体展示技术； 3. 表面等离子共振技术； 4. 蛋白质芯片技术； 5. 细胞共定位技术； 6. 免疫印记技术； 7.免疫共沉淀技术； 8. Pull-down技术； 9. 生物信息学； 10. 结构为基础的功能标识。 2 酵母双杂交系统：Sos招募系统，新型，可用于检 测细胞质内相互作用蛋白，不依赖转录激活 免疫共沉淀：抗原和抗体特异性结合，琼脂糖-蛋白 A/G 蛋白质亚细胞定位：GFP，YFP，RFP, BFP, CFP， 结合Confocal技术 融合蛋白沉降技术(pull-down)：GST，MBP，His 荧光共振能量转移 等温滴定微量热法 生物大分子结构与功能 4 酵母双杂交技术 ? 目的： 利用杂交基因通过激活报告基因的表达， 探测蛋白质-蛋白质的相互作用。 ? 原理： 酵母的GAL4转录因子的BD（1-147位 氨基酸）和AD（768-881位氨基酸）：BD识 别位于GLA4基因的上游激活序列，AD通过与 转录复活体的其他成分作用。两个结构分开时 分别具有功能，但分别作用不能够激活转录。 5 流程： （1）将蛋白X与报告基因转录因子的特意BD 融合，构建成诱饵表达载体； （2）将蛋白Y基因与特异的AD融合，构建成 猎物表达载体； （3）两个重组体在同一酵母细胞中产生的融 合蛋白是否激活报告基因的表达，来确定X 蛋白和Y蛋白是否存在相互作用。 生物大分子结构与功能 6 示意图 7 生物大分子结构与功能 8 染色质免疫沉淀 生物大分子结构与功能 9 噬菌体展示技术 原理： 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单 克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面 就表达出相应的单抗，再将噬菌体过亲和柱， 柱上若含有目的的蛋白，就与相应抗体结合。 分离之后进行鉴定。 用途：研究蛋白质的相互作用。 优缺点： 简便，高通量，可以直接得到基因、 高选择性的筛选复合物、在筛选过程中通过适 当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等。 10 11 4.3 表面等离子共振（SPR） 12 13 14 15 蛋白芯片技术 （一）原理和流程： （1）将大量蛋白质分子按照预先设定的排列固定于载体（如滤 膜等）表面形成微阵列； （2）用标记了特定荧光的蛋白质或其他成分与芯片相互作用； 孵育一段时间； （3）漂洗去未能与芯片上的蛋白质互补结合的成份； （4）利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点 的荧光强度； （5）比较荧光强度来分析蛋白质之间相互作用关系，可定性或 者定量分析蛋白质。 （二）蛋白质芯片技术是一种高通量、微型化 和自动化的技术，可同时分析几百种乃至上千 种蛋白质或多肽。 16 a, Preparation scheme of the supramolecular peptide/protein array. b–d, Fluorescent enzyme activity assay using a supramolecular hydrogel-based peptide chip. Conditions: [peptide] = 20 μM, [gelator] = 0.25 wt% in 50 mM Tris buffer (pH 8.0) at r