分离工程第三章讲义.pptVIP

第三章 沉淀;第一节 蛋白质表面特性;优点 A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高； B、原料液体积很快地减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； C、使中间产物保持在一个中性温和的环境； D、及早地将目标pro.从其pro.水解酶分离出来，避免pro降解，提高产物稳定性； E、用沉淀法作为pro色谱分离前处理，可使使用色谱分离的限制因素降低到最少。 缺点： A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低； B、过滤较困难;1、蛋白质表面特性;1)、水化层(hydration shell) 2)、静电排斥 ? zeta电势 ;3、 蛋白质沉淀方法分类;4、选择方法;5、沉淀操作;第二节 盐析法; 　　　式中, S为蛋白质的溶解度(g/L)；I为离子强度；m为盐的摩尔浓度；β值为蛋白质在纯水中(I=0时)的假想溶解度对数值，是pH值和温度的函数，在蛋白质pI时最小；Ks为盐析常数，与温度和pH值无关。;A、 “Ks”分级盐析法：在一定pH值及温度下，改变盐浓度（即I）达到沉淀的目的。 B、“β”分级盐析法：在一定I下，改变溶液的pH值及温度达到沉淀的目的。 C、应用：一般的初步分离用第一种方法，进一步纯化时用第二种方法。;A、无机盐种类 感胶离子序(Hofmeister序列): In 1888，Hofmeister对一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究。 阴离子排序为：柠檬酸根3- 酒石酸根3- F- IO-3 H2PO-4 SO-4 CH3COO- Cl- ClO-3 Br- NO-3 ClO-4 I- CNS-; 对阳离子排序为： Th4+ Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+ 如何设计实验？ 结论？;结论： a 不同种类的盐主要影响Ks； b 离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。 无机盐的挑选原则： a 较高的盐析效能； b 高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液； c 溶解度受温度的影响小； d 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离； e 不易引起蛋白质的变性； f 价格低廉；; 最常用(NH4)2SO4。优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。 次常用Na2SO4。缺点：在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。;B、无机盐添加方式;C、温度T T影响Cohn方程中的?值。T ?， ? ?；T ? ，? ?。 Why? 一般…， 现在…;D、溶液pH pH影响Cohnx方程中的?值。 见图 图有何用？;第三节 其他沉淀法 ;有机溶剂沉淀法 ;有机溶剂的种类： 丙酮(首选)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀pro。 机理： A、有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电常数降低，而使pro分子间的静电引力（库仑力）增大，导致凝集和沉淀。 B、有机溶剂使pro溶剂化，使原来与pro结合的水被溶剂所取代，从而降低了pro溶解度。这种理论不能说明为什么乙醇比丙酮的亲水性强，丙酮却比乙醇沉淀pro的能力强，也解释不了丙酮、乙醇之类溶剂在所谓脱去pro水膜的过程中容易造成pro变性，而盐析脱水时不造成pro变性。 C、丙酮、乙醇等不仅是pro的沉淀淀剂，而且还是一种变性剂，可见作用有机溶剂使pro在沉淀和变性之间既有区别又相关联。 ;影响因素及控制 A、T：当乙醇与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶液T显著升高，对不耐热的pro影响较大。解决办法：搅拌、少量多次加入，以避免温度骤然升高损失pro活力。另一方面温度还会影响有机溶剂对pro的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全，所以在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度控制在-10?C下进行。 B、[乙醇]：通常随[乙醇]上升，pro溶解度下降。如血纤维蛋白原的最大溶解度在乙醇浓度为8%时达到最大，而当乙醇浓度为40%时达到最小。 C、pH值：在确定了[乙醇]以后，pro最低溶解度出现在蛋白.的pI处，因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白质。 D、[pro]：避免使用很稀的浓度，因pro在高浓度下才较稳定。;优点： A、某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较高， B、从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂； 缺点： A、耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦； B、且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性； C、收率也比盐析法低； D、试剂易燃，有毒。;第四节