酵母杂交的技术原理-应用.pptVIP

目的基因的分离;目的基因的功能克隆;在平板上涂布文库和制备硝酸纤维滤膜的拷贝 然后将滤膜处理（但不能在80度烘烤），暴露菌落或噬菌斑中的蛋白， 在将滤膜放入含有抗体的溶液中，温育一定时间后，洗去未结合的抗体，在加入第二抗体或葡萄球菌蛋白A。第二抗体是用放射性同位素或生物素或酶标记的，通过该标记找到表达产物能与抗体结合的克隆，从而筛选出目的cDNA克隆。;　　自然界中有一些蛋白质的核苷酸编码序列，在其进化的过程中保持着高度的保守性，这样就使核酸的种间杂交成为可能。已知组蛋白在因、肌动蛋白基因及β-神经生长因子（β-nerve hrowth factor，NGF）等基因的核苷酸序列，都是有效的同源DNA探针，并已成功地用于分离相关的基因。　　在同一蛋白质家族内，也存在着具有共同氨基酸序列的区段，即所谓的保守区。这些保守区往往是由彼此相邻的6-7个氨基酸组成，这样的长度显然适合于推导合成寡核苷酸探针库，用来分离编码相关蛋白质的cDNA。;利用差示分析法分离目的基因克隆;酵母双杂交;酵母双杂交系统的建立 ;　　　如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活lacZ报道基因的表达。所以我们可以通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相互作用。 ;1）将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein （诱饵蛋白）的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。 2）将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母 （这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。） 3）当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因ADE、 HIS、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。 ;;;　主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体； b 含DNA-activating domain的载体。 这二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。 　　例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 　　目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147)； LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。 　　常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。;;　　酵母双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。 　　 最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株　具有许多优点: 　　　〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。 　　　〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。 　　　〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。 一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如 GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中， 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白间的结合作用。;??? 酵母双杂交系统通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 　　1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 　　2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。 　　3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 　　4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。;酵母双杂交系统的建立 ;酵母双杂交系统的优点和特点 ;酵母双杂交