蛋白质电泳分离选编.pptVIP

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质4学时;通过实验使学生掌握电泳的基本原理;二、实验原理;pH=pI;2、电泳技术 是利用样品中各带电粒子在电场中的迁移速度不同，从而对样品中分子进行分离、鉴定、纯化和制备。;外在因素;3、电泳的分类;醋酸纤维素薄膜电泳;;血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。;电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，薄膜上显示出五条区带，每条带代表一种蛋白质。;三、实验器材与试剂;2.试剂： 新鲜人血清（无溶血现象） PH8.6缓冲液：巴比妥1.66g、 巴比妥钠12.76g、加水至1000ml，置4℃冰箱保存。 染色液：氨基黑10B 0.5g、 甲醇50ml、 冰醋酸10ml、蒸馏水40ml，混匀溶解贮存。 漂洗液：95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml、混匀。 ;浸泡;1.浸泡：在薄膜粗糙面距一端2cm左右处用铅笔轻轻划一条直线，表示点样位置。将薄膜粗糙面向下，浸泡于PH8.6的巴比妥缓冲液中至少十分钟，使之完全浸泡透。 ;2. 电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。 ;3. 点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后铺在干净的平皿盖上(粗糙面点样)，将毛细管在血清中沾一下，封住上端，在载玻片的一端均匀涂过，使样品连续、均匀、适量，把载玻片在薄膜粗糙面上点样位置轻而温和地印一下。 ;4.电泳：将薄膜粗糙面朝下，平行扣于电泳槽支架的滤纸桥上，膜条点样的一端放在负极上，膜条与滤纸必须贴紧，平衡5分钟后通电。调节电压至90-120V左右，电流强度为0.4—0.6mA/cm，电泳时间40min-1h。 ;5.染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡2-5分钟。 6.漂洗：将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗3-4次至无蛋白区底色脱净为止，可得到色带清晰的电泳图谱。 ;五、实验结果与分析;实际结果;失败图谱的分析; 锯齿状：薄膜用??纸吸水过度（薄膜上出现白斑）或未及时搭桥，导致薄膜过于干燥，使区带成锯齿状。 ? 区带倾斜：薄膜搭载滤纸上的位置歪斜，弯曲，与电流方向不平行，或点样一边多一边少，区带容易泳斜。 ? 区带重叠：在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。 ? 区带过密：电泳时电压，电流过小或时间不够，造成区带未分离。;六、临床意义;肝炎;急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭：白蛋白降低，α1、α2 和β球蛋白升高； 慢性活动性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，β、γ球蛋白升高； 急性炎症：α1、α2球蛋白升高； 慢性炎症：白蛋白降低、α2、γ球蛋白升高； 红斑狼疮、类风湿关节炎：白蛋白降低，γ球蛋白显著升高； 多发性骨髓瘤：白蛋白降低，γ球蛋白升高，β 和γ球蛋白区带之间出现“M”带。;七、注意事项;注意事项;八、思考题？