实验一病毒的鸡胚培养.ppt

实验一 病毒的鸡胚培养;（一）实验目的;（二）实验原理;鸡胚接种技术是养禽业中一种相对新的疫苗接种方法。这种方法就是对孵化后期的鸡胚接种某些活的病毒疫苗。这些病毒疫苗不会对孵化率产生不利的影响，通过这种方式接种疫苗后孵出的雏鸡具有免疫保护力。 ;（三）实验器材;2.接种材料：;（四）实验方法;鸡胚的模式结构 1.卵壳 2.绒毛尿囊膜 3.尿囊腔 4.羊水腔 5.卵黄囊 6.鸡胚胎 7.卵白;b.病毒材料的准备：要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每1000羽份配成250ml,为达到无菌的目的，可在每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各100-500IU，置室温中1h处理。;2.接种; 用带41/2针头的1ml注射器吸取新城疫病毒材料，针头从已经打好的小孔中向鸡胚方向插入1cm，注入0.1-0.2ml病毒液，拔出针头，用溶化的固体石蜡封口，放回孵化箱中孵化，每天翻蛋两次，照蛋一次，24h内死亡者弃去。;取10-12日龄的鸡胚，照蛋选择血管较少的部位做一记号，用磨蛋器磨一于纵轴平行的裂痕，小心挑开蛋壳，将白色的壳膜用针尖小心挑破，不要伤及血管丰富而透明的绒毛尿囊膜，在气室顶端钻一小孔，用滴管贴近小孔，轻轻一吸，绒毛尿囊膜便下陷成一小凹。;将病毒材料一小滴接种于绒毛尿囊膜上，用氯化锌胶布贴封，再用石蜡封好，气室上面的小孔同样封好，培养，注意接种部位必须朝上横卧于孵化器内。 ; 取10-12日龄的鸡胚，消毒气室顶上的蛋壳，并将气室顶端的蛋壳锉一三角形的裂痕，用灭菌镊子揭去裂痕部位的蛋壳和壳膜，用灭菌平头镊子刺破尿囊膜，并轻轻夹去羊膜，用小号针头刺进羊膜腔内，注入0.05-0.1ml的病毒接种液，以氧化锌胶布封口，滴上溶化的固体石蜡。放回孵化器，使蛋直立孵化。; 选择6-8日龄的鸡胚，照蛋检查，划出气室和胎位，并以气室向上竖立在蛋托上，气室端的蛋壳经消毒后以打孔器钻一小孔，将注射针头刺过小孔，沿着卵的纵轴刺入约3cm，然后注入0.2ml的病毒接种液，用氧化锌胶布及石蜡封口后放回孵化器中培养。;鸡胚的各种接种途径 1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种 3.羊水??接种 4.卵黄囊接种;;新城疫在接种24-48小时收毒，收毒前将鸡胚置4 ℃冰箱冷藏4h,以免解剖时血液流出来，收获前先以碘酊和酒精消毒气室部位的蛋壳，用镊子除去蛋壳，用无菌镊子撕开卵壳膜，撕破绒毛尿囊膜而不伤羊膜，用镊子轻轻按住胚胎，以无菌吸管吸取尿囊液于灭菌的疫苗瓶内。 一般可吸取5-8ml,收集到的尿囊液应做无菌试验并冰冻保存。不合格者废弃。;打开气室除去卵壳和卵壳膜后，轻轻夹起绒毛尿囊膜，用灭菌眼科剪将绒毛尿囊膜全部剪下，放入装有生理盐水的无菌平皿中，进行斑痕检查，或取出供切片检查，制造抗原或继续传代使用。;c.羊水;先收集完前两项后，用吸管吸去卵黄液，做无菌检查，然后将整个内容物倾入无菌平皿中，剪取卵黄膜保存，可剪一小块，用无菌生理盐水冲洗后，染色镜检。卵黄液和卵黄膜需放入-25℃冰冻保存。;4.废料处理;（五）实验作业;实验二 病毒的血凝实验（HA）;（一）实验目的;（二）实验原理;（三）实验器材;2.病毒：鸡新城疫弱毒疫苗 3.0.85%生理盐水，微量移液器，96孔板，滴头，微量振荡器。;材料;上述材料全部按顺序加完后，振荡96孔板，使红细胞与病毒充分接触，然后置于20-22℃室温中静置，自第15分钟开始观察结果，每5分钟检查一次，至60分钟结束，观察结果时注意不要摇震96孔板。 ;如果被检材料中有病毒的存在，就会出现红细胞的凝集现象，红细胞出现凝集反应者,凝集成片或碎片,呈伞状铺于管底,不凝集的红细胞沉积于管底,呈一小圆点,将板倾斜,可以看到沉积于底板上的红细胞沿倾斜面呈线状流动.;1．首先观察对照孔，红细胞应无凝集。 2．观察实验孔 ++++全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐，无红细胞沉积。　　 +++ 大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。 　　 ++ 约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。 　　;+只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆盘状，凝集的红细胞在此小圆盘周围。 -不凝集，红细胞沉于管底，成一致密圆盘，边缘整齐。;凝集效价：能使红细胞呈++凝集的病毒最高稀释度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。如上述第7孔为++，则该病毒悬液效价为1：128，即病毒稀释到1：128时，每50μl中含一个血凝单位的病毒。凝集孔数越高,病毒凝集效价越高. 　 4单位病毒：血凝试验（HA）测出病毒的HA价，配制成4单位病毒，装于疫苗瓶中冷冻备用。;材料;（五）实验要点;（六）实验