高氧肺损伤中肺细胞凋亡及JNK信号通路调控机制的论文.docVIP

　　高氧肺损伤中肺细胞凋亡及JNK信号通路调控机制的论文 作者：胡兰，许峰，李静，方芳，匡凤梧，王兴勇，卢仲毅 【摘要】 目的： 观察高氧暴露下肺组织细胞凋亡和磷酸化cjun氨基末端激酶（pjnk）蛋白表达的变化，并探讨jnk信号转导通路对高氧诱导的肺细胞凋亡的调控机制. 方法 ： 48只3 inal kinase，jnk)信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶(motigenactivated protein kinases，mapks)家族中的重要通路之一［4］，其在体内是否参与了高氧肺损伤的发病机制并介导高氧诱导的肺细胞凋亡， 目前 还少见报道. 我们以幼年a公司)；pjnk兔多克隆抗体(美国cell signaling technology公司)；磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)mab（上海康成生物工程有限公司）；po tl/l；空气对照组置于同室空气中（fio2=210 ml/l）；jnk抑制剂sp600125干预组动物经腹腔注射sp600125 30 mg/kg，药物一次性给予，给药2 h后予高氧或空气暴露7 d. 各组环境温度控制在21℃～25℃，湿度50%～60%, 并于每日09∶00开箱10 min，清洁有机玻璃氧仓，添加饲料及饮水. 　　1.2.2标本采集空气对照组（空气暴露第7日取标本）、高氧暴露组（分别在高氧暴露第3，7，14日取标本）、jnk抑制剂干预组（分别在干预后再空气暴露和高氧暴露第7日取标本）动物以35 ml/l水合氯醛（10 ml/kg）腹腔麻醉，开胸，结扎右中肺，剪左心耳，于右心室注入含肝素的生理盐水灌洗肺循环血管，直到左心房流出的液体清亮为止. 分离肺组织，生理盐水漂洗干净，滤纸吸干水分，右中肺经40 g/l多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm切片，he染色，光镜下检查肺组织病理变化；同时行细胞凋亡检测及免疫组化检测. 其余部分置于-70℃冰箱保存，行pjnk in，30 ml/l h2o2室温下（15℃～25℃）封闭10 min，滴加50 μl tunel反应混合液（酶反应液与标记液的比例为1∶9）湿盒中37℃避光湿润反应1 h，再滴加50 μl converterpod,湿盒中37℃避光湿润反应30 min，dab显色，苏木素复染，脱水，透明，封片. 结果判断和图像分析： 胞核呈现棕黄色为阳性细胞. 每张切片随机选5个高倍镜(×400)非重叠视野， 应用 北航病理真彩色图像软件分析系统cm2000b，记数每个视野的凋亡指数（阳性细胞数/总细胞数×100％），再求均值. 　　1.2.4pjnk在肺组织中表达和分布的检测采用二步法免疫组化检测. 切片脱蜡至水，30 ml/l h2o2封闭内源性过氧化物酶5～10 min，热修复抗原，血清封闭20 min，滴加一抗（1∶100），4℃过夜，二抗为hrp标记山羊抗兔igg（1∶1000），37℃孵育20 min，dab显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片. 结果判断：胞核和/或胞质呈现棕黄色为阳性细胞. 　　1.2.5pjnk蛋白含量检测采用mol/l)（trishcl 50，nacl 150，edta 1，naf 50，na4p2o7 2.5，na3vo4 1，triton x100 10 ml/l，甘油100 ml/l，sds 1 g/l，脱氧胆酸钠5 g/l，leupetin 100 μmol/l，pmsf 1）提取肺组织总蛋白（每100 mg组织加入0.5 ml裂解液）， bca比色法定量. 取100 μg待测蛋白按序加样，sdspage电泳后100 v 4℃转移至pvdf膜上，50 g/l脱脂牛奶常温下封闭1 h，滴加一抗pjnk（1∶1000 ）4℃孵育过夜，hrp标记的二抗（1∶2500）常温孵育1 h，ecl化学发光曝光5 min，由chemidocxrs图像采集系统（美国biorad公司）采集图像. 结果分析采用quantity one 4.5.0软件读取各个目的蛋白条带的校正积分光密度值，以gapdh作为内参照，pjnk蛋白含量用apjnk /agapdh表示. 　　统计学处理：实验数据以x±s表示，用spss13.0统计软件进行分析，多样本均数比较用单因素方差分析，组间两两比较用lsdt检验，plt;0.05为差异有统计学意义. 　　2结果 　　2.1肺损伤病理学观察空气对照组及空气＋jnk抑制剂干预组肺组织结构无明显异常. 高氧暴露3及7 d组肺泡上皮细胞肿胀，肺泡壁增厚，肺间质充血、水肿，炎性细胞浸润，肺泡结构紊乱，尤以高氧暴露7 d组更明显. 高氧暴露14 d组肺内炎性渗出减少，水肿减轻，肺间质及成纤维细胞增生明显. 高氧暴露7 d＋jnk抑制剂干预组较高氧暴露7 d