基因工程4是.ppt

基因克隆的载体;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.; 载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能： ;1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。 2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 4、有适合的标记，易于选择。 5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。 6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。 ;载体;载 体;质粒*;第一节 质粒（plasmid）载体  质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。  作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。;　;质粒载体;一、质粒的生物学特性： 1、质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA） 2、不同质粒的分子量大小差异相当显著： 106~108D 3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点 ;L;4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。 抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等 5、质粒DNA的类型： 接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌 素抗性基因的R质粒；F因子和F`因子等。;6、质粒DNA的复制类型： 低拷贝的质粒（1～3）：严紧型复制控制的质粒 （接合型） 高拷贝的质粒（10~60）：松弛型复制控制的质粒（非接合型） 7、质粒的不亲合性 在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性。 是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;（二 ） 、质粒DNA的分离与纯化 1、氯化铯密度梯度离心法； 2、碱变性法； 3、微量碱变性法。 ;1.氯化铯密度梯度离心法 1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。;流程： 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。 将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链的碱基中去。 在EB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。 ;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.