超高效液相色谱（UPLC）在现代分析检验中的应用.doc

超高效液相色谱（UPLC）在现代分析检验中的应用 随着现代社会与科学技术的发展，对各种复杂样品分离分析的要求越来越高，特别是在食品安全、环境监测、药物开发、生命科学等领域。“更快、更好的得到分析检验结果”这是广大分析工作者的愿望。2004年美国Waters公司推出了世界第一台最新研制的超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography， UPLCTM ) 。UPLC借助HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，它给实验室带来了新奇而强大的能力，成为分离分析的一个新兴的领域。UPLC的出现大大拓宽了液相色谱的应用范围和在分离分析科学中的重要地位，为分析化学工作者提供了又一个强有力的技术手段。 图一：Waters公司 ACQUITY Ultra Performance LC? （UPLC） 1　UPLC的基本原理 ?? 采用细粒径填料(117μm)和细内径柱子而获得柱效高达(100，000 -300，000) 的液相色谱技术， 简称超高效液相色谱。UPLC系统是利用创新技术进行整体设计，从而大幅度改善色谱分离度、样品通量和灵敏度的最新液相色谱技术。相对于当今分析速度最快的高效液相色谱(HPLC)，UPLC的分析速度提高了9倍，分辨率提高了2倍，灵敏度提高了3倍，一次分析所得到的信息量大大超过了高效液相色谱。而这一分离分析领域的创新，是基于著名的van Deemter方程，该方程是一个描述线速度和理论塔板高度(柱效)之间关系的经验性方程： ?? 上式中， H为塔板高度，A为涡流扩散系数，B为纵向扩散系数， C为传质阻抗系数，μ为流动相流速。由于式中A、C两项与填料颗粒度( dp )之间的关系为： A∝ dp； C∝ ( dp)2 ，因而方程式(1)可表达为： ?? 从式(2)可明显看到，随着色谱柱中装填固定相粒度dp的减小，色谱柱的塔板高度H也愈小，色谱柱的柱效越高，说明柱效(N)与颗粒度( dp)成反比： 另一方面，液相色谱分离度与柱效(N)的平方根成正比： ?? (4)式中k2是容量因子，α是选择性系数，N是理论塔板数。可见，随着颗粒度dp的降低，柱效N增加，进而Rs值也增加。由于分离能力用峰容量衡量，单位时间的峰容量越高，表明可以分离出的色谱峰越多，分析的分辨率越高。这也说明了可以通过减小色谱柱中装填固定相颗粒度来提高色谱柱的柱效和分离度。除提高柱效和改善分离度外，依据van Deemter理论可进一步推测，减小固定相粒度还可在分析速度、灵敏度方面提高色谱分离分析的效能。总而言之，由van Deemter理论可以得到几点启示：色谱柱中装填固定相的颗粒度是对色谱柱性能产生影响的最重要的因素。首先，颗粒度越小柱效越高；其次，不同的颗粒度有各自最佳柱效的流速；最后，更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速(线速度)方向移动，而且有更宽的线速度范围。所以降低颗粒度不但能提高柱效，同时还能提高分析速度和灵敏度。但是，要真正在技术上实现超高效液相色谱分析，除必须使用小颗粒固定相外，还必须解决色谱系统的一系列问题。如：小颗粒填料的耐压问题和小颗粒填料的装填问题，这包括颗粒度的分布以及色谱柱的结构；色谱系统的耐压问题，包括超高压下溶剂输送及系统的耐压防渗；快速自动进样与减少进样交叉污染问题；高速检测及扩散问题；高速数据的采集及管理、仪器系统控制问题等。只有达成上述这几个单独领域的技术创新并进行优化组合，才能促成超高效液相色谱的实现。 图二：Agilent 1200快速液相色谱仪 ? 2　实现超高效液相色谱的技术条件 ?? 为了使液相色谱的分离效率和分离速度等性能上达到新的高度，UPLC在多项色谱技术方面进行了改进与创新。 ?? 1)应用杂化颗粒技术合成了新型全多孔球形117μm反相固定相色谱填料，并采用新型的装填技术，制备了高柱效的色谱柱。 ?? 2)制造超高效液相色谱的输液泵。对10 cm长的装填117μm颗粒的色谱柱而言，达到最佳柱效的流速时，其计算的理论柱压约15000 p si。因此需要一个可以在此压力下传送溶剂的泵。另外溶剂在此压力下的压缩性有显著变化，尤其是在多溶剂梯度分离条件下。因此为色谱柱装备了一台用独立柱塞驱动，可进行4种溶剂切换的二元高压梯度泵。此溶剂输送系统在很宽压力范围内具有补偿溶剂压缩性变化的能力，并在等度或梯度分离条件下保持流速的稳定平滑和重现性。 ? ?3)超高压液相色谱的高速检测器。就理论而言，使用117μm颗粒填料的UPLC系统可以产生半峰宽小于1秒的色谱峰，这就对UPLC的检测器提出了挑战。首先当色谱峰通过检测器时，检测器必须有一个非常高的采样速度和非常小的时间常数