细菌的分离培的样及鉴定.ppt

细菌分离培养及鉴定;细菌的分离培养 细菌的染色镜检 细菌的生化试验 ;一、细菌分离培养;1、需氧菌的分离鉴定;几种常见的划线方法;;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;操作方法： 1、左手持平皿，用左手的拇指、食指和中指将平皿盖揭开呈20°左右的角度； 2、右手持接种环，从混合培养物中沾取少许混合物涂布在培养基边缘，然后将接种环多余的混合物在火焰中烧灼，待冷却后，再与所涂混合物的地方轻触，在空白区划线，后再烧灼，冷却后再在空白区划线，反复操作，直至混合物稀释到足够形成单菌落。;注意事项： A 划线前先将接种环稍弯曲，使其和平皿内琼脂面平行，不致于划破培养基。 B 划线中尽量不要重复、往复划线，以免形成菌苔。 C 划线接种完毕，在平皿底部写上菌名、日期和接种者等标记，然后倒扣培养。;2、厌氧分离培养;二氧化碳厌氧法： * 简单的二氧化碳培养法可在盛放有培养物的有盖玻璃缸内，燃点蜡烛，盖上玻璃缸盖，当火焰熄灭时，该缸内空气二氧化碳浓度大约增加了5%～10%。 * 化学方法生成二氧化碳，碳酸氢钠与硫酸钠或碳酸氢钠与硫酸作用即可生成二氧化碳。 * 现在实验室设备中，已有二氧化碳培养箱，只需把二氧化碳的浓度设置成所需浓度即可达到相应的厌氧环境。 ;生物学方法： * 原理：利用培养基中含有的植物或动物组织消耗氧气的原理制成。植物或动物的组织具有呼吸作用，组织中的可氧化物质也可以消耗培养基中的氧气。 * 植物组织包括马铃薯、燕麦、发芽谷物等； * 动物组织包括新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等。 * 目前比较常用的有厌气肉肝汤培养基、碎肉培养基等。 ;化学方法： * 原理：利用还原性比较强的物质将培养环境或培养基内的氧气吸收。 * 连二亚硫酸钠、碳酸钠和氧气反应生成硫酸钠、亚硫酸钠和二氧化碳，消耗环境中的氧气； * 每100立方厘米空间用1g焦性没食子酸及10ml 10%氢氧化钠或氢氧化钾，焦性没食子酸在碱性溶液中吸收大量氧气，生成焦性没食橙。;物理学方法： * 原理：利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成厌氧环境，利于厌氧菌的生长。 * 常用的方法有厌氧罐法、真空干燥器法、高层琼脂法、加热密封法等。;3、纯培养与移植;注意事项： A 接种环（针）火焰烧灼灭菌后要稍冷却后再挑取菌落； B 打开平皿，接种过程保持无菌状态，尽量靠近酒精灯燃心； C 接种后，培养小管或平板要置于适宜条件，利于细菌生长； D 穿刺培养，接种针要直刺直出，不要反复戳刺； E 芽孢菌耐杀灭，培养芽孢菌的实验室最好单独使用，否则要彻底灭菌。;二、细菌抹片的制备及染色;1、细菌染色原理;2、细菌抹片的制备;B 抹片： 液体材料：如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环沾取一环材料，在载玻片中央均匀涂布成适当大小的薄层。 非液体材料：如菌落、脓、粪便等，现用接种环取少量生理盐水置于载玻片中央，然后在用灭菌接种环沾取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。 组织脏器材料：可先用镊子夹持中部，然后用灭菌剪刀剪去一小块，用其新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成一薄层。;C 干燥：一般采取自然干燥法。 D 固定：火焰固定和化学固定 火焰固定：干燥好的抹片涂抹面向上，背面在酒精灯外焰上来回摆动几次，略加热，但不能太热，不烫手为宜。 化学固定：血液、组织脏器的抹片做姬姆萨染色不用火焰固定用甲醇固定。将已干燥的抹片浸入甲醇中2～3min，自然挥发干燥。;3、细菌染色方法;革兰染色法： * 原理：机理仍不清楚，一般认为与细菌细胞壁的结构和化学成分有关。 革兰阴性菌细胞壁含有较多的脂类，当以95%酒精脱色时，脂类被溶去，使细胞壁孔隙变大，尽管酒精处理能使肽聚糖孔隙变小，但因为肽聚糖含量较小，细胞壁收缩有限，故能让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物被酒精洗脱出细胞壁之外，而被后来红色的复染剂染成红色。 革兰阳性菌细胞壁所含脂类少，肽聚糖多，酒精脱色时，细胞壁孔隙缩小到不易让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物洗出细胞壁外，而被染成紫色。 ;操作方法： 1、在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，1～2min后，水洗； 2、滴加革兰氏碘溶液于抹片媒染，作用1～3min后，水洗； 3、滴加95%酒精于抹片上脱色，作用20～30s，水洗； 4、滴加沙黄水溶液或石炭酸复红溶液复染1min，水洗； 5、用吸水纸吸干或自然干燥，镜检； 6、结果，革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。;注意事项;三、细菌生化试验;