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分子荧光分光光度法测定面粉中 的核黄素 复旦大学 化学教学实验中心 张晋芬 一、实验目的 1、学习荧光分析法的基本原理及荧光的测 定方法； 2、掌握面粉的制样方法； 3、了解荧光分光光度计的主要结构、工作 原理及使用方法。 二、内容提要 某些物质经紫外光或可见光照射后，会发射出 荧光（较入射波长更长），荧光光谱能反映这些物 质的特性。根据荧光强度和波长的分析方法称为荧 光分析法。 对同一物质，在稀溶液（即A=abc 0.05）中有： F=2.3ФfabcI0 式中F 荧光强度 Ф f 荧光过程的量子效率； a 荧光分子的吸光系数；b 试样的吸收光程； c 物质的浓度； I0 入射光强度。 当I0 、b不变时： F=Kc 荧光分析法灵敏度高（较分光光度法大2~3 个数量级）、样少、快速等特点,在食品、 医药、农业、环保、化工等领域广泛应 用。 但由于许多物质不会发生荧光，故在使用 范围上受到一定的限制。 维生素B2又称核黄素。冬春季寒冷干 燥，有的人嘴唇会出现干裂，其主要原因 是缺少维生素B2 缺乏维生素B2会影响生 物氧化，还会得舌炎、眼结膜炎、角膜炎 等。动物内脏维生素B2含量高其次是奶、 蛋、豆类等。小麦虽然是维生素B2的良好 来源，但由于这些营养成分大部分集中在 麦粒的外壳中，所以在面粉加工的过程中 大部分损失掉了，精加工的面粉维生素与 矿物质的损失更加严重。 维生素B2每人每天摄入量不低于0.5mg . ? 维生素B2 在430~440nm蓝光照射下发出荧 光，峰值波长为525nm左右，在pH 6~7的溶 液中荧光最强，pH= 11时荧光消失。 ? 在稀溶液中，荧光的强度与维生素B2的浓 度成正比，利用维生素B2的这一性质，选 择合适的激发波长、荧光波长和实验条 件，可对维生素B2进行定量测定。 ? 本实验采用标准曲线法来测定维生素B2的 含量。 F-4500荧光分光光度计： 主机、计算机工作站、GP-IB通信 接口卡 F-4500荧光分光光度计的工作原理 ——主机 ? 光源（氙灯） ? 单色器：激发单色器 发射单色器 ? 样品池（低荧光材料） ? 检测器（光电倍增管、摸/数转 换器、微处理器） ? 微处理器 由GP-IB通信接口卡与 计算机连接 仪器功能： 激发/发射波长扫描、 荧光强度测定、时间扫描、三维 荧光光谱扫描 ? 工作原理： 氙灯产生的连续光由激发单色器 色散出具有一定光谱通带的单色光， 照射在样品上激发后产生的荧光，由 发射单色器色散成荧光光谱，并由光 电倍增管检测荧光强度，通过模/数转 换器转换为数字信号，经主机微处理 器由GP-IB通信卡传送到计算机工作 站。计算机工作站将接受到的数字信 号进行处理，由显示器显示数据及谱 图。 三、实验步骤 1、样品溶液的制备（两人制备一份） 准确称取均匀的面粉样品7~8g；加入70~80ml 0.1mol·L-1盐酸溶液(先加入几ml ，搅拌成稀糊 状，如有块状此时要用玻棒按压使颗粒分散后， 再将剩余部分加入），加入150 ml沸水，煮沸 30min以上。冷却后在搅拌下用NaOH溶液调节pH值 至6.0~6.5，再用HCl溶液调至4.5。 将混合物定量转移至250 ml容量瓶中，用1%醋 酸溶液定容（因气泡，定容时可加1滴丁醇），先 离心（注意使用离心机时保持平衡）再过滤（在 砂芯漏斗中放一层滤纸），取20 ml左右清晰滤液 避光保存，待测。 2、实验条件的选择 （1）激发光波长（入射光波长）EX 荧光波长（发射光波长）EM 的选择 ①将荧光分光光度计的荧光波长（发射光波长）EM暂设定为 525nm处，在400~500nm波长范围内对EX进行扫描，确定最 佳的EX（最高峰值处）。 ②然后将激发光波长（入射光波长）EX设定在最高峰值处， 在500~600nm波长范围内对EM进行扫描，确定最佳的EM （最高峰值处）。 （2）酸度的选择 分别用1：1盐酸、1%醋酸、5%氢氧化钠定容1.00ml核黄素标 液于25ml容量瓶中，测定pH值并测定荧光强度，考察酸度 对荧光强度的影响，确定最佳的调节pH的溶液。 3、