新编 微生物手册1.doc

微生物检验标准化手册 第 PAGE 23页，共22页 PAGE  PAGE 23 一、微生物操作基本知识 1、玻璃器皿的准备 1.1清洗 一般的玻璃器皿可用毛刷及洗涤剂去灰、尘油垢、无机盐等物质，再用自来水冲洗，然后用蒸馏水洗2～3次，将器皿倒叩备用。 用过的玻璃器皿需高压灭菌20分钟或在5%的碱液里煮沸数分钟后，刷洗。 洗涤剂常用洗衣粉、肥皂，对一些还原性或有机物污垢，可用重铬酸钾清洗。 重铬酸钾清洗液配方： 浓配方 重铬酸钾40g 自来水160ml 浓硫酸800ml 稀配方 重铬酸钾50g 自来水850ml 浓硫酸100ml 1.2玻璃器皿的包扎 1.2.1试管 洗净、干燥的试管，塞上棉塞，棉塞入管2/3，管外留1/3，同规格的数支试管用棉绳捆扎在一起，试管上半部分外包牛皮纸，再用棉绳捆扎紧后灭菌。 1.2.2移液管 先把移液管吸的一头塞上少量脱脂棉，然后每支吸管用片宽约5cm的长纸条，以约450的角度螺旋形紧卷起来，吸管尖端在头部用纸条卷包，口吸端用剩余纸条折叠打结，装入盒内干热灭菌备用。 1.2.3培养皿 10个培养皿一组叠放在一起，装入培养皿筒内，干热灭菌备用。 1.2.4三角瓶 三角瓶每个需要单独塞好棉塞，用牛皮纸包扎棉花塞头部，用棉绳扎紧灭菌。如果瓶内装有待灭菌的物质如培养基、生理盐水等，应注明。 2、灭菌 微生物检验的整个过程都必须在严格的无菌条件下进行，各种检验用具必须经过无菌处理。 2.1实验室常用的灭菌方式 2.1.1化学灭菌 此法适用于微生物操作过程中不能用加热、紫外线的地方，如人手、操作台、取样台等。 75%酒精溶液 5%石炭酸（苯酚） 1～2%甲醛（福尔马林）液：用于熏蒸室内空气 5%高锰酸钾溶液 2.1.2物理灭菌 紫外灯灭菌 用于无菌室的台面和空气灭菌，打开紫外灯30分钟后，关闭紫外灯，待30分钟后方可进入无菌室。 火焰灭菌 直接在火焰上燃烧灭菌,如接种用具(针、环、涂布棒等)，灼烧取样口，试管、三角瓶口等。 干热法 在恒温干燥箱里进行，在180℃恒温下，保持300分钟，此方法适用于一般玻璃器皿、金属等耐热物品。 高压蒸汽灭菌 在密闭的高压灭菌锅内，由于增加灭菌锅内的压力，使水的沸点上升，达到比高于100℃的蒸汽，从而达到灭菌效果。 采用高压灭菌锅，一般为0.107Mpa(121℃)，15～20min，含糖高的培养基应采用0.072Mpa， 15～20min。 煮沸灭菌 灭菌物品在沸腾蒸馏水中煮沸0.5小时，（如集菌法采用的膜）或在蒸锅内利用蒸汽灭菌0.5小时（如风取样器），可达到灭菌效果。 3、无菌室要求： 3.1无菌室高度：2.2-2.5m； 3.2 紫外灯配置：30w/10－15m2； 3.3 地面、墙壁、设备表面杀菌：采用浓度为75％的乙醇擦拭。 3.4空间灭菌 紫外灯灭菌：至少每天一次，每次30分钟； 紫外灯关闭，30分钟后方可进入室内。（常规微检应打开操作台的风机，纯生打开操作台紫外灯） 加热熏蒸：按2ml/m3的计算量取甲醛溶液，盛在小铁筒内，用铁架支好，在酒精灯内注入适量酒精，在室内各种物品准备妥当后，点燃酒精，关闭门窗，任甲醛溶液煮沸挥发。 氧化熏蒸：准备一玻璃容器，称取高锰酸钾（甲醛用量的1/2）倒入，室内准备妥当后，把甲醛溶液倒在盛有高锰酸钾的器皿内，立即关门。熏蒸后关门密闭应保持12小时以上。 1.8.5定期检测无菌室超净工作台的无菌程度。方法：平皿暴露法 将已灭菌的营养琼脂培养基倒入已灭过菌的90mm培养皿内，每皿约15ml培养基，启开皿盖暴露于无菌室内，10 min后，盖好皿盖。 将培养皿倒置，于37℃培养24小时后，观察菌落情况，统计菌落数。 如果每一个培养皿内菌落不超过4个，则可以认为无菌程度良好，若菌落数很多，需进一步对无菌室进行灭菌。 4、培养基的配制程序： 4.1培养基的配制 4.1.1取500 ml洁净的三角瓶称量：(营养琼脂9g、麦康凯10.4g、麦汁琼脂10g、PCA3.5g、WLN15g)配料溶解(200ml纯净水)调PH包扎三角瓶灭菌（121℃湿热灭菌15分钟）。 4.1.2培养基标识 各种培养基应有明确的标记：培养基名称、配制日期、配制人、保质期 4.2平板制备 4.2.1将已配制好的培养基放置于电炉上，小火加热至完全溶化 4.2.2将熔化好的培养基冷到50℃左右，在酒精灯下打开瓶塞，将瓶塞倒置放在超净台的工作台上，不许与其它物品相碰。 4.2.3右手拿培养基（三角瓶），打开瓶塞后的培养基瓶口应始终在火焰旁并且尽量保持与火焰呈垂直状态，左手拿好无菌平皿，在火焰旁迅速打开一侧（即让平皿的上、下盖的一部分打开，二者之间不能彻底分开），其开启程度应使培养基瓶口能够深入平皿内，又不能碰到上下平皿盖为宜