bcrabl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病样模型的建立.docVIP

　　bcrabl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病样模型的建立 【摘要】 目的: 构建bcrabl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病（CML）样模型,为深入 研究 CML发病机制和 治疗 奠定基础. 方法 : bcrabl逆转录病毒Mig210载体经PhoenixAmpo细胞包装后,取上清液感染5FU 处理后的BALB/c雄性小鼠骨髓细胞,再经尾静脉移植入经致死剂量γ射线（900cGy）照射的同种雌性受体鼠中.用形态学、RTPCR和L模型,可用于后续CML信号通路和治疗机制的研究. 【关键词】 慢性粒细胞白血病 BCR 融合蛋白 逆转录病毒载体 动物模型 　0引言 　　慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是一种起源于骨髓内异常多能干细胞的骨髓增殖性疾病,其发病机制复杂,但持续表达的bcr/abl融合基因在该病的形成过程中起重要作用. 目前 在含有bcr/abl融合基因的细胞模型上进行研究的报道较多. 对CML体内研究的模型主要是基于bcrabl转化的造血细胞株在小鼠体内的定殖,以及用K562细胞移植裸鼠成瘤后,再接种到免疫缺陷型小鼠致白血病的方法［1］.而利用逆转录病毒转染的小鼠骨髓移植模型研究人类白血病细胞的发生、 发展 及其生物学特性,并用来进行实验治疗,是20世纪90年代以来国外白血病实验研究的新发展［2］,国内尚未见报道.本课题拟探索建立bcrabl逆转录病毒Mig210骨髓转染/移植诱导的小鼠白血病样模型,为后续CML信号通路和治疗机制的研究奠定基础. 　　1材料和方法 　　1.1材料BALB/c小鼠，6~12 a公司产品;抗cabl多克隆抗体、二抗为抗兔IgHRP,羊抗鼠αtubulin mAb，ECL显色试剂盒均购于Cell Signaling公司;rmIL3，rmIL6，rmSCF均购于PeproTech公司. 　　1.2方法 　　1.2.1逆转录病毒上清的制备将Mig210和MigRI空载在jetPEITM的介导下转染PhoenixAmpo细胞,36 h后收集第一批病毒上清,72 h后收集第二批病毒上清,用有限稀释法感染NIH3T3细胞计数绿色荧光测病毒滴度,达到1×1011~1×1012IU/L离心过滤,存于-80℃备用. 　　1.2.2供体鼠骨髓细胞的制备尾静脉注射雄性供体BALB/c小鼠5氟尿嘧啶（5FU）,4 d后处死小鼠取骨髓，用DMEM预激培养基（含胎牛血清、EM培养基,病毒和细胞在20℃,1000 g离心90 min共沉降,2~4 h的吸附后更换培养基,48 h后进行第二轮重复上述的转导和共沉降,吸附2 h后收集细胞,用DHanks洗涤，计数有核活细胞. 　　1.2.4感染逆转录病毒的骨髓原代细胞的回输雌性受体小鼠照射前5 d接受抗生素直到移植后2 RNA的逆转录参照TakaLa RTPCR试剂盒说明书操作步骤得cDNA.人bcr/abl融合基因上游引物为5′GCAAGCTTACCATGGACATCCGTGG3′,下游引物为5′GTCGACCTTGCCATCAGAAGC3′,扩增片段为654 bp. PCR扩增条件：94℃ 8 min，94℃ 1 min,57℃ 1 min,72℃ 90 s, 72℃ 8 min,32个循环. 小鼠的βactin基因的上游引物为5′ACACTGTGCCCATCTACGAG3′,下游引物为5′CACAGGATTCCATACCCAAG3′, 扩增片段为 336 bp.PCR产物电泳后在数字化凝胶成像仪上观察，并做DNA测序. 　　1.2.5.3Western Blot法检测受体鼠骨髓和脾脏P210蛋白的表达提取骨髓细胞和脾脏组织蛋白, SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白后电转移到PVDF膜上,转印膜封闭过夜后,分别加入cabl抗体及rtubulin抗体,再分别加入二抗IgHRP,ECL法显色后于化学发光成像仪上显影并保存图像. 　　统计学处理：各组数据以x±s表示,采用SPSS11.5统计软件进行t检验. 　　2结果 　　2.1受体小鼠存活状态观察经γ射线照射的受体小鼠次日出现畏冷、恐慌、相拥缩成一团，1 .　　2.2受体小鼠血液细胞学检查外周血白细胞计数及涂片分类结果发现：经γ射线照射后的小鼠白细胞计数在0×109~0.2×109/L,外周血涂片偶见2:DL2000 Marker. 　　图5RTPCR检测各组小鼠造血组织bcr/abl融合基因的表达（略） 　　图6移植小鼠造血组织bcr/abl融合基因阳性片段DNA测序结果（略） 　　2.5L动物的建模 方法 目前 主要有以下四种:①bcr/abl转化的造血细胞株在小鼠体内的定殖模型,主要用于 研究 b