丙型肝炎病毒不同编码区His融合抗原的表达与纯化.docVIP

　　丙型肝炎病毒不同编码区His融合抗原的表达与纯化 作者：韩振格，乔伟振，张敏，孙艳雯，董晨，孟继鸿 【摘要】 目的：表达和纯化丙型肝炎病毒（HCV）Core、NS3和NS4的His融合抗原HC、HNS3和HNS4，并初步探讨其在抗体检测中的 应用 。 方法 ：用重组基因工程技术，构建3种重组质粒CpET28ac(+)、NS3pET28ac(+)和NS4pET28ac(+)以及相应的工程菌；质粒经双酶切、PCR和测序鉴定正确后，IPTG诱导抗原表达，从IPTG使用浓度、诱导温度与时间3个方面优化抗原表达条件；用NTA柱纯化抗原后，分别用单片段重组抗原和混合抗原以酶联免疫吸附试验（ELISA）检测100份HCV抗体阳性血清和40份健康人血清。结果：用单片段重组抗原和混合抗原检测的100份HCV抗体阳性血清中，HC、HNS3和HNS4的抗体阳性率分别为91%、75%和52%，而HC、HNS3和HNS4混合抗原的抗体检出率为100%；检测40份健康人血清，结果全部为阴性。结论：HCV不同编码区单片段His融合抗原具有不同的抗体检出率，但均低于混合抗原的阳性率；在开发HCV抗体诊断试剂时，应采用HCV混合抗原。 【关键词】 丙型肝炎病毒； His融合抗原； 抗原纯化； 表达 常用的HCV感染诊断方法主要是用ELISA检测抗HCV。 目前 ，国内外HCV抗体检测试剂均已开发了3代产品，其包被抗原大多采用基因工程抗原［12］，主要包括HCVCore、NS3和NS4。虽然现在普遍应用的第3代ELISA检测试剂的质量较前两代有了很大提高［3］，但仍存在一定程度的假阳性和漏检［48］，如何提高HCV抗体ELISA检测试剂的质量是一个亟待解决的 问题 。而探索和开发更好的HCV抗原，是完善抗体检测试剂盒的关键。我们在以往 研究 HCV重组抗原［910］的基础上，应用基因工程的方法，表达和纯化HCV His融合抗原HC、HNS3和HNS4，用血清学方法对其抗原性进行了初步鉴定，为进一步研制高质量的HCV抗体检测试剂奠定基础。 1 材料和方法 1.1 重组质粒的构建与鉴定 以3种重组质粒CpGEX4T2、NS3pGEX4T2和NS4pGEX4T2（美国CDC惠赠）为模板，分别用PCR方法扩增HCV结构与非结构区基因Core、NS3和NS4。PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；然后92 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35个循环；最后一个循环结束后延伸8 min。 PCR产物用3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit（上海申能博彩生物 科技 有限公司）回收。质粒载体pET28ac(+) 和PCR产物分别用BamHⅠ和XhoⅠ酶切；将酶切后的3种PCR产物分别与酶切后的质粒载体pET28ac(+) 连接；取5 μl连接产物转化100 μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，取100 μl菌液涂布于含硫酸卡那霉素（K+）的LB培养基平板，涂匀后置37 ℃培养过夜。挑取能在 K+LB 培养基上生长的菌落接种K+LB液体培养基，37 ℃震荡培养过夜。用 Plus Minipreps DNA Purification Systems （Promega）抽提质粒。重组质粒经PCR、双酶切、测序进行鉴定。 1.2 His融合抗原的诱导表达 将鉴定正确的重组质粒[CpET28ac(+)、NS3pET28ac(+)、NS4pET28ac(+)]分别转化大肠杆菌BL21感受态细菌。取100 μl菌液涂布于K+LB培养基平板，涂匀后置37 ℃培养过夜。 挑取在K+LB培养基上生长的菌落接种K+LB液体培养基，37 ℃震荡培养过夜，次日转1 ml过夜培养菌液至100 ml K+LB液体培养基，37 ℃摇床继续培养至OD600 nm=0.6，平均分入5支已高压灭菌的50 ml大试管，再加入IPTG(Sigma) 至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mmol·L－1，37 ℃继续培养1 h，收集细菌沉淀，SDS/PAGE确定抗原表达量较高时所需较低的IPTG浓度（即适宜诱导剂浓度）；用此浓度IPTG，分别在25、28、30、35及37 ℃ 诱导抗原表达的收集细菌沉淀，SDS/PAGE确定抗原表达量较高时的适宜诱导温度；用适宜IPTG浓度，在适宜的诱导温度下诱导抗原表达0.5、1、1.5、2及3 h，收集细菌沉淀，超声裂解细菌，4 ℃ 10 000 r·min－1离心15 min，分别收集细菌裂解上清和沉淀，SDS/PAGE确定适宜诱导表达时间，