中西医联合用药对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞bcl2和bax基因表达的影响.docVIP

　　中西医联合用药对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞bcl2和bax基因表达的影响 【摘要】 [目的]观察不同 治疗 方法对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞bcl2和bax基因表达的影响。[方法]将40只雄性SD大鼠随机分成正常对照组、糖尿病对照组、盐酸二甲双胍治疗组、中药治疗组和中西医联合用药组，小剂量两次腹腔注射链脲佐菌素诱发糖尿病大鼠模型。中药治疗组和中西医联合用药组在造模前15天就进行预防性给药(以中药补肾通窍方煎剂灌胃)。西药组和中西医联合用药组在成模后给以盐酸二甲双胍给药。成模6H group)，Chinese medicine treated group(C group)，Chinese edicine bined treated group(Cetformin hydrochloride inistered into the rats in MH and C)是一种常见的，由于胰岛素分泌缺陷及(或)其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。本实验通过观察不同方法治疗前后糖尿病大鼠视网膜神经节细胞bcl2和bax基因表达情况，探讨中药补肾通窍方辅助西药盐酸二甲双胍对糖尿病大鼠视网膜凋亡相关基因表达的影响。 　 　1 材料和方法 　　1.1 动物 选择由浙江中医药大学动物实验中心提供的清洁级健康成年熟雄性SD大鼠40只，体重(220±30)g，喂以平衡饲料，自由进食。 　　1.2 药物、试剂及引物 (1)药物：补肾通窍方为一临床经验方，由熟地15g，淮山药15g，枸杞子15g，黄芪15g，太子参15g，麦冬15g，五味子10g，当归15g，川芎15g ，葛根15g组成，购于浙江中医药大学附属第一 医院 浙江省中医院中药房，上述中药每剂煎两次，合并煎液过滤浓缩至3g生药/ml药液，放入无菌容器中4℃保存备用。盐酸二甲双胍0.25g/片，北京中惠药业有限公司生产，国药准字号：HI9983069)捣碎以蒸馏水配制成混悬液，每毫升含药物成分0.02g，置于4℃冰箱保存备用。(2)试剂：链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购自Sigma公司。Trizol试剂购自Inxitogen 公司，bcl2和bax引物委托生物公司合成。(3)引物设计与合成：引物序列如下：bcl2上游引物：5′GTGGGGAGCGTCAACAGG3′，下游引物：5′GACAGCCAGGAGAAATCAAAC3′;bax上游引物：5′ GGGCTGGACACTGGACTTC 3′，下游引物：5′ AGCGAGGCGGTGAGGACT3′;GAPDH 上游引物：5′GACAACTTTGGCATCGTGGA3′，下游引物：5′ATGCAGGGATGATGTTCTGG3′，委托上海生物公司合成。 　　1.3 分组及造模 大鼠饲养一周后随机分为五组：正常对照组(C组)，糖尿病组(DM组)，盐酸二甲双胍治疗组(X组)，中药治疗组(Z组)和中西医联合治疗组(ZX组)，每组8只。用0.1mol/L新鲜配制的枸橼酸枸橼酸钠缓冲液(PH=楼航芳，等: 中西医联合用药对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞bcl2和bax基因表达的影响 　　4.4)配制2%STZ，过滤除菌后备用。除C组外其余四组大鼠分两次分别在禁食12h后腹腔注射STZ40mg/kg体重剂量造模，C组大鼠一次性腹腔注射同等剂量的枸橼酸枸橼酸钠缓冲液，3d后重复一次腹腔注射STZ(25mg/kg)。7d后测尾静脉血非禁食血糖(美国强生One TouchⅡ血糖仪)，血糖大于16.7mmol/L，尿糖(～)，上述指标持续1周的动物为成功的糖尿病大鼠模型。自确定成模后，每周记录尿糖2次，称量体重1次，测空腹血糖1次。 　　1.4 给药 Z组和ZX组大鼠在造模前15天开始以补肾通窍方煎剂( 13.05g/kg)灌胃给药，C组和DM组大鼠给以同等剂量去离子水灌胃，X组大鼠成模前给以同等剂量去离子水灌胃，成膜后每天以盐酸二甲双胍混悬液( 0.09g/kg)灌胃。 　　1.5 眼球的取材及切片 成膜后第6m处剪开眼球壁，去除眼前节和玻璃体，投入液氮中以备荧光PCR检测。 　　1.6 荧光PCR实验方法 (1)RNA提取：①取出样品，加入预冷TRIzol试剂1ml，用研磨器冰浴研磨10～15min，室温放置5 min;②加入氯仿0.2 ml，用力振摇，室温放置23 min;③4℃最大转速12，000 g离心15 min，吸取上层水相，移置另一离心管;④加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min;⑤4℃最大转速12，000 g离心10 min，弃上清;⑥加入75%乙醇1 ml，充分洗涤沉淀后于4℃、10000 g离心5 min，弃上清，室温干燥;⑦加入