人外周血来源内皮祖细胞与成熟血管内皮细胞生物学性状比较.docVIP

　　人外周血来源内皮祖细胞与成熟血管内皮细胞生物学性状比较 作者：张菲斐，韩战营，邱春光，杨海波，黄振文，陈庆华，李凌，赵洛沙 【摘要】 目的：探讨成人外周血来源的内皮祖细胞（EPC）与成熟血管内皮细胞在抗原表达、细胞形态、增殖潜能和体内外血管生成方面的异同点. 方法 ：密度梯度离心法获得单个核细胞，用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中. 细胞在接种后每2 h去除1次未黏附细胞共2次，然后隔日换液1次，直到晚期克隆出现. 同期培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行比较. 流式细胞技术检测细胞表面抗原表达，直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化低密度脂蛋白. 体外培养细胞的群体倍增次数确定细胞增殖潜能，胶原凝胶细胞体外种植及裸鼠体内移植实验分别测定体外及体内血管生成功能. 结果： EPC在培养21~28 d出现，表现出典型的内皮细胞“铺路石”外貌. 与HUVEC相比，EPC表达高水平的CD36和KDR（EPC vs HUVEC, Plt;0.01），但表达CD146，结合植物凝集素和摄取乙酰化低密度脂蛋白在两种细胞间未存在统计学差异. 体外培养100 d，EPC和HUVEC分别传代46次和25次，只有EPC能在体外和裸鼠体内胶原凝胶中形成管腔样结构. 结论：人外周血来源的EPC虽然具备成熟内皮细胞的表型和形态特点，但仍保留干/祖细胞的完整生物学特征. 【关键词】 血管生成；内皮细胞；祖细胞；生物学性状 0引言 内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）原始储存部位在骨髓，受缺血信号刺激后向外周血释放，募集到缺血部位参与血管新生. 但另有 研究 却发现， EPCs在肿瘤血管新生、受损血管内皮修复、或成年动物体内血管再生方面，所起作用很小或几乎不起作用［1-3］. 我们研究首先确认外周血循环中是否存在有真正的EPCs，然后将其与成熟内皮细胞进行完整生物学性状对比 分析 . 1材料和方法 1.1材料Histopaque，1.077,FITC标记的植物凝集素（Ulex europaeus agglutinin1, UEA1）、纤连蛋白（fibronectin）、FITC标记的抗VEGF2受体（KDR）、I型胶原均为Sigma公司产品；添加各种生长因子和胎牛血清的内皮细胞完全培养基（EGM2 MV Single Quots）和I型胶原酶为Becton Dickinson公司产品；DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiIAcLDL）购自AbD Serotec公司；vNC）. 用Hanks洗涤MNCs 3次，重悬于EGM2，调整细胞计数2×109/L，接种于100 mg/L纤连蛋白包被的24孔培养板中. 另在无菌条件下取正常剖腹产健康新生儿脐带20~30 cm，PBS冲洗脐静脉腔， I型胶原酶灌注，37℃水浴消化15min. 收集消化液、离心、洗涤，EGM2调整细胞计数2×109/L，接种于纤连蛋白包被的培养瓶中，取2~3代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vEin endothelial cells, HUVEC）用于实验. 1.2方法根据单核细胞在体外培养时具有短期松散附壁的特点， 应用 序列黏附法去除淋巴细胞的混杂. 每例血样在分离出MNC并接种后每隔2 h去除1次未黏附细胞，共2次，然后加入EGM2静止培养，4 d后换液. 此后隔天换液1次，直至典型的内皮细胞克隆出现，然后消化传代，取2~3代细胞进行实验. 1.2.1表面抗原表达的测定贴壁细胞用PBS洗涤2次，2.5 g/L胰酶/EDTA消化后制成细胞悬液，密度为1×109/L. 每份细胞悬液取150 μL×2分装2个试管，分别加入FITICD14，FITCCD146，FITCKDR，PECD34及同型对照mAb各20 μL，避光反应30 min，PBS洗涤2次测定，每例均以流式细胞术复测3次. 上机后收集20 000个细胞，荧光强度以对数放大，结果以各种抗原表达阳性百分率表示. 1.2.2内皮细胞v2配置浓度为2 g/L的I型胶原溶液，100 g/L碳酸氢钠滴定溶液pH值7.4~7.6，加入96孔板中每孔100 μL，37℃放置30 min使其成胶. 分别将2~3代贴壁的EPC和HUVEC制成细胞悬液，加入凝胶之上每孔5×104个细胞，置培养箱内孵育，不同时间点倒置显微镜下观察血管生成情况. 1.2.5体内血管生成实验无胸腺裸鼠22只，7~11 ol/L HEPES, 100 mL/L胎牛血清、300 mL/L EGM2制备浓度为3 g/L的胶原溶液. 将等量的细胞悬液与胶原溶液混合，每只裸鼠后肢SC细胞胶原溶液1 mL. 将裸鼠置于饲养笼28℃