从纤支镜刷落细胞提取微量RNA并检测Foxp3基因表达.docVIP

　　从纤支镜刷落细胞提取微量RNA并检测Foxp3基因表达 【摘要】 目的　建立纤维支气管镜刷落细胞提取微量核糖核酸（RNA）的方法，检测分析调节性T细胞（Treg）Foxp3基因在肺癌及肺良性疾病患者中的表达水平。方法　以磁珠吸附法提取154例肺癌及肺良性疾病患者纤支镜刷脱细胞的微量RNA，以实时荧光定量RT-PCR的方法检测Treg特异性转录因子Foxp3基因在肺癌及肺良性疾病患者中的表达水平。结果 平均总RNA提取量为5.08μgRNA/例，最低为3.20μg，最高为15.25μg。肺癌患者组中Foxp3 mRNA的表达水平（0.0000~13682.0805，四分位数间距0.0011）显著高于肺良性疾病组（0.0000~0.0061，四分位数间距0.0000）（Z=－3.508, P＜0.01），肺癌患者组中Foxp3的阳性率（29.34%，27/92）亦明显高于肺良性疾病组（3.23%，2/62） （χ2=16.535，P＜0.01）。结论 利用纤支镜毛刷刷取病灶部位涂片后毛刷中的剩余细胞，采用磁珠吸附的方法可以提取微量RNA，并用于基因表达水平的检测。 【关键词】 纤维支气管镜 刷落细胞 微量RNA提取 Foxp3 [Ａｂｓｔｒａｃｔ] Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To setup protocol for RNA isolation from bronchofibroscopic brush-off cells and analyze the expression of Foxp3 in samples of lung carcinoma and benign disease patients. Methods Total RNA bronchofibroscopic brush-off cell samples of 154 patients a and benign lung diseases by magic-bead total RNA isolation method. Real-time fluorescent quantitative RT-PCR ean yield of total RNA ple, ple and the highest as of 15.25μg/sample. The expression level of Foxp3 in lung cancer patient samples (0.0000~13682.0805, interquartile range 0.0011) ples (0.0000~0.0061, interquartile range 0.0000) (Z=-3.508, P＜0.01), and the positive rate of Foxp3 in lung cancer patient samples (29.34%, 27/92) ples (3.23%, 2/62)(χ2=16.535, P＜0.01). Conclusions Total RNA can be isolated from bronchofibroscopic brush-off cells by magic-bead method and used for further detection of gene expression. [Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ] ibronchofibroscope;　brushing-off cell;　RNA isolation;　Foxp3 肺癌是我国发病率较高的肿瘤之一，对临床标本进行基因检测有利于肺癌的诊断、 治疗 方案制订及预后判断。纤维支气管镜术是临床上对肺部疾病患者常用的检查方法，我们利用纤维支气管镜毛刷刷取病变部位涂片后毛刷中剩余的刷落细胞，共收集154例肺癌及肺良性疾病患者的刷落细胞样本，建立了提取微量RNA的方法，并检测分析其中与肿瘤生长密切相关的CD4+CD25high Treg细胞[1]特征性标记Foxp3 mRNA的表达水平。 1　资料与方法 1.1　一般资料　标本来源：154例纤维支气管镜刷落细胞标本均取自于2006年4月至2007年5月邵逸夫 医院 （门诊和住院患者）内镜室，所有标本均经刷落细胞和组织病 理学 检查，其中肺癌92例，肺良性疾病62例。 1.2　主要试剂和仪器　总RNA纯化试剂盒Maga- Bio（BSC53S2）、逆转录酶、Taq酶等，均购自杭州博日科技有限公司。Foxp3上下游引物序列[2]分别为5-GAGAAGCTGAGTGCCATGCA-3和5-AGGAG-CCCTTGTCGGATGAT-3，探针序列为FAM-5-CACAGATGAAGCCTTGGTCAGTGCCA-3