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　　低分子姬松茸多糖对Bel 作者：牛英才 赵学梅 张春 林春荣 李雪岩 刘吉成 【摘要】 目的探讨低分子姬松茸多糖(a loolecular Agaricus blazEI, LMPAB)对人肝癌细胞Bel-7402端粒酶-RNA mRNA表达的影响。方法5，10和20 μg·ml-1浓度的LMPAB处理体外培养的Bel-7402细胞48 h后，采用原位杂交法检测端粒酶-RNA mRNA表达。结果LMPAB下调体外培养Bel-7402 端粒酶-RNA mRNA的表达，呈剂量依赖性。与空白对照组比较，端粒酶-RNA mRNA的表达差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论LMPAB具有下调端粒酶-RNA mRNA表达的作用，进而降低端粒酶活性，抑制肿瘤细胞生长。 【关键词】 低分子姬松茸多糖 抗肿瘤 端粒酶 端粒酶是目前所发现的恶性肿瘤最为广谱的分子标记，在绝大多数恶性肿瘤中阳性表达，而在造血细胞和胚胎肝细胞以外的正常组织细胞内为阴性表达，端粒酶活性是恶性肿瘤发生重要标志之一［1］。肿瘤细胞经化疗杀伤或诱导分化后端粒酶活性显著降低，提示针对端粒酶活性的药物可能为 治疗 肿瘤提供新的途径［2］，端粒酶可作为抗肿瘤治疗的一个新靶点。多糖是由单糖连接而成的生物大分子物质，多糖的糖链能控制细胞的增殖和分化，调节细胞的生长与衰老，在抗肿瘤和促进免疫力方面疗效明确，毒副作用小［3］。近年来，多糖的抗肿瘤活性研究受到越来越广泛的关注。本研究采用原位杂交法，观察低分子姬松茸多糖（a loolecular Agaricus blazei, LMPAB）对Bel-7402细胞端粒酶-RNA mRNA表达的影响，探讨LMPAB抗肿瘤的机制。 1 器材与方法 1.1 材料 1.1.1 药物 LMPAB由齐齐哈尔医学院医药 科学 研究所分离提取［4］；猪苓多糖注射液购自江苏省正大天晴药业股份有限公司；姬松茸粗多糖购自浙江庆元博瑞药业有限公司。 1.1.2 细胞 Bel-7402 细胞株购于 中国 农业科学院哈尔滨兽医研究所。 1.1.3 试剂与仪器 DAB kit/DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；RNase-free H2O（宝生物工程有限公司）；RPMI-1640 MEDIUM cell culture reagents（Hyclone）；Trypsin 0.25% Solution（Hyclone公司）。PM-20型全自动显微摄影仪（日本OLYMPUS）；COIC型倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；Motic Med 6.0数码医学图像分析系统（北京麦克奥迪图像技术有限公司）。SuperFrostPlus原位杂交专用载玻片（美国Erie科技公司）；原位杂交专用盖玻片（武汉博士德生物工程有限公司）。 1.1.4 杂交探针序列 端粒酶-RNA：①5-TAGGC GCCGT GCTTT TGCTC CCCGC GCGCT-3；② 5-AAAAT GTCAG CTGCT GGCCC GTTCG CCCCT-3；③5-GATTC CCTGA GCTGT GGGAC GTGCA CCCAG-3。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 从液氮罐中取出保存Bel-7402冻存管，迅速放置37℃温水中轻轻摇动，使其尽快融化。在超净工作台内用酒精消毒冻存管后，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管，并加10倍培养液，混合后低速离心，除去上清液，重复洗涤细胞1次。分别加入5 ml DMEM培养液，吹散细胞，将细胞悬液吸至培养瓶中，放入37℃、5% CO2浓度的培养箱中培养过夜。次日，观察细胞生长贴壁情况，更换新鲜培养液，继续培养。待细胞生长到覆盖80%瓶底壁时，准备传代。倒掉瓶内旧培养液，加适量0.25%胰酶，使消化液流遍所有细胞，37℃消化细胞约5 min，显微镜下观察细胞变形，加入含血清的培养液终止消化，并用吸管轻轻反复吹打贴壁的细胞，使细胞完全脱落。将细胞悬液移入离心管，1 500 r/min离心5 min，弃上液，加入适量DMEM培养液吹散细胞。取适量细胞悬液在显微镜下用细胞计数板计数，然后按一定细胞数量分别接种于新的培养瓶中，放入37℃、5% CO2浓度的培养箱中培养。 .L.编辑。 1.2.2 细胞爬片的制备 当Bel-7402细胞处于对数生长期，倒掉培养瓶内旧培养液，加适量0.25%胰酶，37℃消化约5 min。显微镜下观察，细胞脱落变形后，加含血清培养液终止消化，并用吸管轻轻反复吹打，使贴壁细胞完全脱落。将细胞悬液移入离心管，1 500 r/min 4℃离心5 min，弃上液，加入适量的DMEM培养液吹散细胞。取适量细胞悬液计数，用RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清）将细胞悬液浓度调整为1×105 c