低氧肺动脉高压大鼠的肺动脉组织凋亡.docVIP

　　低氧肺动脉高压大鼠的肺动脉组织凋亡 作者：刘婷 李运成 钱桂生 张志远 杨昱 王关嵩 【摘要】 目的 研究bcl2、bax凋亡相关基因在低氧处理大鼠肺动脉中的表达，探讨低氧肺动脉高压的发病机制及防治措施。方法 36只C)的增殖可能是导致PH形成的重要环节，增加平滑肌细胞凋亡可以逆转PH肺血管重建〔2〕。在bcl2基因家族中，bcl2是凋亡抑制基因，bax是凋亡诱导基因，二者比率是影响细胞凋亡的关键。以往体外研究〔2〕发现，低氧可以促进肺动脉平滑肌细胞的增殖，而低浓度CO可以部分抑制低氧对肺动脉平滑肌细胞的作用。为深入探讨其机制，本研究利用全自动缺氧舱复制低氧性PH大鼠模型，分别给予常氧、低氧、低氧与低浓度CO处理，观察肺动脉bcl2、bax基因的变化，探讨PH发病机制，为其防治提供新的思路。 　　1 材料与方法 　　1.1 低氧PH大鼠模型制备及处理分组 　　选择健康成年雄性erck产品) 消化，37℃孵育5 min；0.1 mol/L甘氨酸/0.1 mol/L PBS漂洗5 min；4%多聚甲醛漂洗5 min；0.1 mol/L PBS漂洗5 min×3，再2×SSC漂洗10 min；预杂交后置42℃水浴中2 h；在每张片子上加20 μl地高辛标记探针杂交液，用DEPC水处理的膜覆盖，于湿盒中42℃孵育20 h；取出切片，去膜，4×SSC及PBS充分漂洗；滴加AntiDigAp抗体；NBT/BCIP室温避光显色4～6 h；0.05 mol/L PBS充分漂洗，终止显色反应；中性树胶封片。原位杂交染色结果的判定，以细胞浆和胞膜内出现明确的紫蓝色细颗粒为阳性染色。无阳性信号(-)；弱阳性(+)，阳性细胞≤25%；弱阳性()，阳性细胞26%～50%；强阳性 ()，阳性细胞51%～75%；强阳性()，阳性细胞gt;75%。 　　1.4 免疫组织化学 　　所用的抗体bcl2为兔抗人单克隆抗体，购自加美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶50；bax为兔抗人多克隆抗体，购自加美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶30；生物素标记的二抗为羊抗兔多克隆抗体，购自武汉博士德公司，工作浓度1∶200。具体方法参见〔4〕。结果判定：背景无颜色，胞浆内着棕黄色颗粒为阳性细胞。无阳性信号(-)；弱阳性(+)，阳性细胞≤25%；弱阳性()，阳性细胞25%～50%；强阳性()，阳性细胞50%～75%；强阳性()，阳性细胞gt;75%。 　　1.5 统计学分析 　　实验结果应用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析，组间率的比较用χ2检验。 　　2 结果 　　2.1 原位凋亡结果 　　荧光显微镜下可见低浓度CO组肺动脉组织有明显的凋亡标记，而常氧组仅见很弱的荧光。正常对照组、低氧肺动脉高压组、低浓度CO组的阳性率分别为8.1%，37.6%，76.5%三者差异显著(Plt;0.01 )，见图1。 　　2.2 原位杂交检测结果 　　bax、bcl2 mRNA阳性细胞细胞浆和细胞膜着紫蓝色颗粒，均匀着色，阳性细胞呈不均匀分布。正常对照组bax、bcl2杂交呈微弱的紫蓝色，为弱阳性表达(+)。低氧PH组bax杂交呈中等强度的紫蓝色，为弱阳性表达()，低浓度CO组呈极强的紫蓝色，为强阳性表达()；但bcl2杂交,可见低氧PH组细胞胞浆呈强的紫蓝色，为强阳性表达()，低浓度CO组呈微弱的紫蓝色，为弱阳性表达(+)，见图2。 　　2.3 免疫组织化学染色的情况 　　结果表明，正常对照组免疫组织化学染色bcl2、bax均很弱；低浓度CO组bcl2、bax均有升高，以bax为著 (78.9%)，与低氧PH组比较有显著差异(P＜0.01)；低氧PH组bax虽然也有表达，但程度较弱，且bcl2表达处于优势(80.0%)，与低浓度CO组比较有显著差异(P＜0.01)。肺动脉凋亡主要发生在内皮细胞和平滑肌细胞，见图2、表1、表2。表1 各组大鼠肺动脉bcl2凋亡的蛋白质表达情况，表2 各组大鼠肺动脉bax凋亡的蛋白质表达情况（略）。 　　3 讨论 　　近年来，随着细胞凋亡在肺动脉高压研究中的不断深入，人们已经注意到肺动脉高压时，肺组织细胞可以细胞凋亡方式出现，并在发病中起到一定作用。bcl2被认为是细胞凋亡调控的最后通路之一，其属于跨膜蛋白，主要分布于核膜、线粒体膜和内质网膜上。bcl2和bax同属于bcl2家族，但二者功能相反，bcl2抑制凋亡的促进增殖，而bax促进细胞凋亡〔5〕。一般认为bcl2通过控制细胞核内外物质的运输和抑制Ca2+的释放或阻断细胞内过氧化物的堆积而发挥抗凋亡作用。而bax作为bcl2的同源体，其作用是抑制bcl2作用，其与bcl2基因一样在组织广泛