琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶的特性.ppt

DNA的琼脂糖凝胶电泳分离 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。 与蛋白质分子相似，核酸分子也是两性解离分子，在pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，磷酸根全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。 分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。所以采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离目的，在loading buffer的作用下，可观察电泳的进行情况。 垂板电泳槽 转移电泳槽 平板电泳槽 双向电泳槽 电泳操作步骤 2、胶床准备 ①取出胶床和梳齿，将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有一定的间隙 ③将胶床放在调整好的水平台上 1、凝胶准备 用1×TAE配制1.2％琼脂糖凝胶。 ① 称1.2 g琼脂糖置三角瓶中，加100ml，1×TAE ② 微波炉加热大约1-2分钟，熔化琼脂糖 ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时（手掌轻触感觉热但是刚能够承受），加入EB，5μl（10 mg/ml），并轻轻混匀 3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶 床内，凝胶厚度3～5mm（注意在胶床的一个角落倒胶， 同时不能间断，防止倒胶不均或产生气泡；一旦产生气泡， 立即用枪头小心挑出） 4、室温下静置半小时左右，凝胶固化。 将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极 6、向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越 过凝胶表面即可 5、轻轻拔出固定在凝胶中的梳齿。 7、样品准备：手套上向核酸样品中加入6*的上样缓冲液， 用加样器轻轻混匀。样品上10 ul，缓冲液上2 ul。 8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝 胶的样品孔中。加样量一般小于20 μl 9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：电压120v；时间0.5小时左右，置于碎冰中 10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 11、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电源条带 ②摄影记录 Dye :与样品结合并使其显一定的颜色以指示样品在凝胶中所处的位置。 DNA：Ethidium Bromide, EB(溴乙啶) inlayed into DNA double strands. 10ng Argent(银试剂) Ag+ very sensitive 0.5ng 溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。 电泳缓冲液的组成 Tris—乙酸（TAE） Tris—硼酸（TBE） Tris—磷酸（TPE） 其浓度约为50mmoL/L，这些缓冲液均含有EDTA。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于室温。 常用的电泳缓冲液的配制 缓冲液 使用液 浓贮存液（每升） Tris—乙酸（TAE） 1×：0.04moL/L Tris—乙酸 0.001moL/L EDTA 50×：242g Tris碱 57.7mL 冰乙酸 100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0) Tris—磷酸（TPE） 1×：0.09moL/L Tris—磷酸 0.002moL/L EDTA 10×：108g Tris碱 15.5mL 85%磷酸 40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) Tris—硼酸（TBE） 0.5×0.045moL/L Tris—硼酸 0.001moL/L EDTA 5×：54g Tris碱 27.5g硼酸 20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) 加样缓冲液 缓冲液类型 6×缓冲液 贮存温度 I 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 4℃ II 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青