抗果蝇Trio蛋白抗体的制备及鉴定.docVIP

　　抗果蝇Trio蛋白抗体的制备及鉴定 【摘要】 目的：制备兔抗果蝇Trio蛋白的抗体。 方法 ：以RTPCR扩增Trio的1 173 bp的基因片段并克隆入pET28a(＋) 和pGEX4T1 (His)6C表达载体中，表达并纯化TrioHis、TrioGST融合蛋白。用纯化的TrioHis融合蛋白免疫家兔产生抗Trio的抗体，用TrioGST亲和层析法进行纯化并采用ega公司，限制性内切酶、T4连接酶及高保真DNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；小量胶回收试剂盒为TaKaRa公司产品；His亲和层析柱购自Clontech公司，Br活化的抗体纯化亲和层析柱Sepharose 4B为Amersham Pharmarcia公司产品；a公司,HRP标记的羊抗兔IgG为Promega公司产品；雄性新西兰家兔体质量约2.5kg,购自本校实验动物中心。 1.2 方法 ［3］ 1.2.1 目的基因的扩增 从野生型黑腹果蝇幼虫中提取总RNA，并逆转录为cDNA进行PCR扩增。上游引物的序列为 5′GCGCGGATCCGCCAGCCCCGGCAAATGG3′，下游引物的序列为5′GCGCCTCGAGTTTGGTTGACAGGGGATTGG3′（划线部分分别为BamHⅠ、Xho Ⅰ酶切位点）。PCR反应的参数为：94 ℃预变性3 min；94℃变性30 s，53℃变性1 min，72 ℃延伸1 min，共34个循环;最后72 ℃延伸10 min。获得Trio 1 173 bp的基因片段。 1.2.2 重组质粒的构建与鉴定 PCR产物分别经BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳。割胶回收酶切片段，与经同样酶切的质粒pET28a(＋)和质粒pGEX4T1 (His)6C于16 ℃连接过夜。以连接产物转化大肠杆菌DH5α，并涂布于含相应抗生素[质粒pET28a(＋)为卡那抗性,终质量浓度为25 mg·L-1；质粒pGEX4T1 (His)6C为氨苄抗性，终质量浓度为50 mg·L-1]的固体培养基上，于37 ℃过夜培养。挑阳性菌落，提取质粒，进行BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切和测序鉴定，得到重组质粒pET28a(＋)-Trio和pGEX4T1 (His)6CTrio。 1.2.3 目的蛋白的原核表达及纯化 将经酶切和测序鉴定的重组质粒pET28a(＋)Trio和pGEX4T1 (His)6CTrio分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中，于37 ℃培养过夜。次日按1∶50接种至1 L含卡那霉素（终质量浓度为25 mg·L-1）的新鲜LB液体培养基中，于37 ℃振荡培养至细菌浓度的A600 nm约为0.6，加IPTG至终浓度为0.1 mmol·L-1，于37 ℃诱导表达3 h，离心收集菌体。菌体用1×PBS(pH 7.4)重悬，经超声裂解后，以10 000 r·min-1离心10 min收集上清和沉淀。经SDSPAGE分析表明，表达的目的蛋白主要位于包涵体内。用缓冲液A(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1 NaH2PO4、10 mmol·L-1 TrisHCl，pH 8.0)溶解包涵体，取上清于Ni2+NTA树脂层析柱中;用缓冲液B(8mol·L-1尿素、100 mmol·L-1 NaH2PO4、10 mmol·L-1 TrisHCl，pH 6.3)洗柱，直至A280 nmlt;0.01;用缓冲液C(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1 NaH2PO4、10 mmol·L-1 TrisHCl， pH 4.5)洗脱目的蛋白。收集的目的蛋白用SDSPAGE进行分析。 1.2.4 动物免疫及抗血清的制备 ［4］ 将纯化的TrioHis融合蛋白用BCA蛋白定量试剂盒进行定量后免疫家兔2只，每只每次融和蛋白的用量为200 μg。初次免疫用完全弗氏佐剂乳化蛋白,皮下多点注射，2周后加强免疫，用不完全弗氏佐剂乳化蛋白。以后每间隔2周加强免疫1次,共加强免疫3次。经心脏取血,并分离血清，加0.2 g·L-1叠氮钠后于-70 ℃保存备用。 1.2.5 抗体的纯化 将纯化的GSTTrio融合蛋白分别与Br活化的Sepherase 4B层析柱结合，制备亲和层析柱(按Sigma公司操作手册)。将免疫血清加于该层析柱中于4 ℃结合过夜。次日依次用1×PBS(pH7.4)、1×PBS(含2 mol·L-1 NaCl, pH 7.4)、1×PBS(pH 4.5)洗涤杂蛋白，最后用0.1 mol·L-1甘氨酸溶液(pH 2.8)进行洗脱。将洗脱液与1 mol·L-1 TrisHCl(pH 9.5)溶液按20∶1的比例混合,加入1 g·L-1 NaN3,于4 ℃保存备