氯离子对东方拟无枝酸菌发酵产物的影响.docVIP

　　氯离子对东方拟无枝酸菌发酵产物的影响 作者：周雨朦 洪文荣 阮林高 陈代杰 戈梅 【摘要】 本文研究了氯离子对东方拟无枝酸菌发酵产物的影响。在常规培养条件下，改变发酵培养基中氯离子存在形式或是添加抑氯剂和溴化钠，都发现了新组分无氯万古霉素(didechlorovanycin，DDCV)的产生。通过对培养基中添加抑氯剂的量的改变，发现加入0.005% 2巯基苯骈噻唑和0.1%溴化钠时万古霉素产量降至对照的6%，而DDCV的相对含量达到62%。 【关键词】 无氯万古霉素； 抑氯剂； 溴化钠 ABSTRACT This study focused on the effect of chorine on the fermentation products of Amycolatopsis orientalis. Changing the form of inorganic salt of Chloride anion or adding its inhibitor and NaBr into the medium, a neum fermentation medium bromide 收稿日期：20070903 修回日期：20071127 作者简介：周雨朦，女，生于1982年，在读硕士研究生。 * 通讯作者，Email:hong. 万古霉素(vanycin)是由东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)发酵产生的一种糖肽类抗生素［1］，是目前临床上用于 治疗 耐甲氧西林金葡菌(MRSA)引起的严重感染的重要药物［2］。但是，随着耐万古霉素的金葡菌(VRSA)和肠球菌(VRE)的出现，导致临床上治疗感染性疾病又出现了新的棘手问题，严重威胁着人类的生命健康。我们从研究万古霉素的结构类似物入手，寻找新的对耐药菌更有效的药物。 在研究万古霉素组分的过程中，在某培养基的发酵产物中发现了一个含量较低的未知组分，针对该组分进行研究，最终确定此组分为无氯万古霉素(didechlorovanycin，DDCV)。在发酵优化方面，借鉴 工业 上生产四环素的方法， 在培养基中添加抑氯剂和氯的竞争性抑制剂，可获得较高产量的无氯万古霉素。 1 材料与方法 1.1 菌株 东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)HCCB10007(上海来益生物药物研发中心保藏)。 1.2 试剂和仪器 本实验所用试剂纯度均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。HPLC型号：Agilent 1100 Series公司；MS型号：QTOF micro (l/250ml三角瓶，摇床转速220r/min，培养48h。 (3)发酵摇瓶培养条件 培养温度28℃，相对湿度40%～60%，装量25ml/250ml三角瓶，摇床转速220r/min，接种量8%，培养120h。 1.5 无氯发酵实验、组分取代实验和抑氯剂添加试验 (1)无氯发酵实验 以发酵培养基作为对照，用去离子水配制发酵培养基，考察以等量的硫酸镁取代氯化镁对万古霉素及其他组分合成的影响。培养条件同1.4。 (2)组分取代试验 以发酵培养基作为对照，用去离子水配制发酵培养基，分别考察以等量的硫酸镁、氯化钠、氟化钠、溴化钠代替氯化镁对万古霉素及其他组分合成的影响。培养条件同1.4。 (3)抑氯剂添加试验 以发酵培养基作对照，然后在对照培养基中加入不同浓度的2巯基苯骈噻唑和溴化钠，考察添加物对发酵结果的影响。培养条件同1.4。 1.6 发酵组分和效价测定 发酵液中万古霉素及其相关产物的含量分析参照2000版《美国药典/国家处方集》(USP24/NF19)中万古霉素的HPLC分析方法进行。 1.7 生物活性测定 参照《 中国 药典》2000版二部附录XI中的方法。 2 结果与讨论 2.1 无氯发酵实验 试验发现无氯培养基的发酵液中万古霉素含量远远低于自来水配制的对照组，经HPLC分析还发现了一个新的组分，将其记作V13。HPLC图谱见图1。 2.2 V13组分的分离、鉴定及理化性质 为了对新组分V13做进一步的研究，通过发酵积累、分离纯化，获得纯度为94%以上的新组分V13，经质谱分析显示分子量为1379D，其分子量与万古霉素比较相差68D，相当于2个氯原子。由于发酵培养基中去除了氯离子，因此结合此发酵方案，理性推断V13为无氯万古霉素，其化学结构如图2所示。DDCV外观为白色粉末，略带棕色；易溶于水，微溶于甲醇，不溶于丙酮与乙醚。 2.3 组分取代实验 以若干不同无机盐分别替代发酵培养基中的氯化镁组分，各相关组分对产生无氯万古霉素(DDCV)的影响见表1。 表1 不同发酵培养基发酵结果