结核分枝杆菌Rv0309抗原的重组表达、纯化和鉴定.docVIP

　　结核分枝杆菌Rv0309抗原的重组表达、纯化和鉴定 作者：蒋天舒，娄加陶，周晔，陈燕，陈波，谷明莉，仲人前，邓安梅 【摘要】 目的 重组表达结核分枝杆菌Rv0309蛋白，以进一步探讨其免疫效应。 方法 将结核分枝杆菌抗原Rv0309的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX4T1中，构建成Rv0309重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达，进一步经GST亲合层析柱纯化，经SDSPAGE和ycobacterium tuberculosis，Mtb)，每年新发病约800万，死亡约200万[1]。近年来，结核分枝杆菌多重耐药菌株不断增加， 经济 全球化产生人口大规模流动，使结核病的发病率和死亡率呈上升趋势。卡介苗(BCG)是 目前 唯一可用的抗结核疫苗。 研究 表明，BCG可预防儿童结核性脑病，但在不同的人群和地域中其保护力差异很大，并且对结核病主要流行和传播形式的成人结核病，预防效果不佳[2]。因此，研发新型结核疫苗以替代卡介苗势在必行，选择理想的候选抗原对于研制有效的疫苗至关重要。 　　国外有研究采用基因芯片技术和生物信息学 分析 ，从Mtb基因组中筛选出多种可能的高表达、分泌型蛋白或（和）脂蛋白，其中包括Mtb中高度保守的脂蛋白Rv0309。本研究在此基础上，对Rv0309进行重组表达，以进一步研究其免疫原性，为新型结核疫苗的研制打基础。 　　1 材料与方法 　　1．1 质粒、血清与菌株 质粒pGEX4T购自Am Phamacia公司，美国。 　　结核病血清来源于本院住院病人。大肠埃希菌BL21均为本实验室保存。 　　1．2 PCR引物设计与合成 　　参照结核分枝杆菌H37Rv0309的全序列，设计上下游引物。上游引物为5’GCTGGATCCGGCTTGCCGGTGAGATA3’，下游引物为5’GCACTCGAGACGGCGGCGTTGGCGACGTTT3’，在上、下游引物5’端分别引入BamH I、Xho I 酶切位点和保护碱基，以便于酶切和克隆。 　　1．3 工具酶和主要试剂 　　限制性内切酶BamH I、Xho I购自Takara公司；T4DNA连接酶购自Roche公司；Taq酶、IPTG购自上海博光生物 科技 有限公司；辣根过氧化物酶购自Dako公司。DNA凝胶回收试剂盒购于Oxoid公司。 　　1．4 Rv0309抗原编码区的扩增 　　结核分枝杆菌H37Rv株接种Sauton培养基于37 ℃ 培养7周，DNA的提取和纯化参照 　　2．2 Rv0309基因在BL21菌株中的表达及纯化 　　将含有pGEX4TRv0309质粒的大肠埃希菌BL2l菌经IPTG诱导表达，进行15%SDSPAGE蛋白电泳，发现在相对分子质量约为23 000处，与未经IPTG诱导菌株相比，有一条明显蛋白条带，同预计的大小一致(图2)。将菌体蛋白超声后的上清用亲和层析的 方法 纯化后获得了一条单一的蛋白条带，大小为45 000 左右，与预期的结果相一致。 　　2．3 D.Current medical treatment for tuberculosis\[J\].BMJ,2002,325(30):1282-1286. 　　\[2\] Berthet F X, Rasmussen P B,Rosenkrands I,et al. A mycobacterlum tubemdosis operon encoding ESASr’6 and a noval loulatory molecule2deficientdendritic cell progenitors(MHC class Ⅱ+,CD80dim,CD862)prolong cardiac allograft survival in nonimmuno supp ressedrecip ients\[J\].T ransp lantation,1996:62(5):659. 　　\[4\] Brandt L,FEInocunlm J, S,Shaila N R,Chandrab B,et al.A bined immunoinformatics and structurebasedmodeling approach for prediction of T cell epitopes of secretory proteins of mycobacterium tuberculosis\[J\].Microb Infect,2006,8:738-746. 　　\[8\] 吴传勇,娄加陶,蒋廷旺,等.结核杆菌抗原多表位融合蛋白的重组表达与鉴定\[J\].第二军医大学学报,2006,27(12):1281.