腹腔内注射腺苷对大鼠海马区cfos表达的影响.docVIP

　　腹腔内注射腺苷对大鼠海马区cfos表达的影响 作者：付立波 王学斌 刘凤莲 宋迎 【摘要】 　　目的 研究腹腔内注射腺苷对大鼠海马区cfos蛋白表达的影响。方法 腹腔内注射腺苷和其非特异性受体阻断剂茶碱，采用Fos免疫组织化学染色(ABC法)，观察cfos蛋白在海马区内的分布情况。结果 注入腺苷后大鼠海马区的cfos蛋白表达与注入生理盐水相比明显增加，注入茶碱后大鼠海马区的cfos蛋白表达与对照组相比无显著变化。结论 腺苷能促进海马区cfos蛋白的表达，腺苷在海马区内对调节睡眠可能有重要作用。 【关键词】 腺苷；海马区；cfos；免疫组织化学染色法 　　腺苷（Adenoisine,Ado）作为中枢神经系统（S）的一种神经调质，可降低S神经元的兴奋性，在中枢许多部位具有抑制作用〔1，2〕 。Ado在S中直接或间接参与睡眠、镇静和镇痛等作用，是重要的睡眠调节因子之一。在缺血、缺氧和血流灌注不足的情况下，大脑中的Ado浓度迅速上升，内源性Ado对代谢增加和能量不足引起的组织损伤具有保护作用，对睡眠具有促进作用。许多睡眠因子，如白介素（IL）1，褪黑素等，通过使S内cfos蛋白及cfos mRNA表达水平提高促进睡眠〔3〕。海马区是重要的中枢部位，cfos基因在海马组织受到轻微刺激时就能表达。本实验采用腹腔内注射Ado和免疫组织化学方法，观察Fos蛋白在海马区的分布情况，为进一步明确Ado在大鼠海马区对睡眠的调节提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物与试剂 　　采用200～250 g雄性纯种l，继以灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）500 ml进行固定，60 min后断头，取出脑组织，置于含4%多聚甲醛的PBS（0.1 mol/L）中后固定2 d，取相应海马区的脑组织块，用石蜡包埋，修块，并用LKBⅢ型超薄切片机切成 5～8 μm切片。 　　1.2.2 Fos免疫组织化学染色(ABC法) 　　将石蜡切片脱蜡和水化，之后用PBS（0.01 mol/L，pH7.4）冲洗3次，每次3 min。在每张切片上加一滴过氧化酶阻断剂（试剂A），即用抗原修复液对组织抗原进行修复，室温下孵育15 min。取出切片， 每张切片加50 μl过氧化酶阻断溶液（抗体），室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3 min。甩去PBS，每张切片加50 μl正常非免疫动物血清（试剂B），室温下孵育30 min。 除去血清，每张切片加50 μl的兔抗人cfos多克隆抗体，4℃过夜。PBS冲洗3次，每次3～5 min。除去PBS，每张切片加50 μl生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。 除去PBS，每张切片加50 μl链霉菌抗生物素过氧化酶溶液（试剂D），室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。 除去PBS，每张切片加100 μl新配制的二氨基联苯胺（DAB）溶液，观察3～10 min。自来水冲洗，苏木素复染，PBS冲洗返蓝。切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。 　　1.2.3 结果判断 　　细胞质中有红色颗粒者为阳性细胞，每只大鼠随机取5张切片，在400倍镜下计数核团内一个视野的Fos免疫反应阳性神经元（foslike）的数量，取其平均数。在观察切片时，每张切片计数3个高倍镜视野。 　　1.3 统计学分析 　　采用SPSS11.0软件进行分析，计量数据以x±s表示，两组间均数用配对样品t检验进行显著性比较。 　　 2 结果 　　大鼠腹腔内注入Ado后，海马区内cfos蛋白表达为28.6%±8.37%，而注入生理盐水组cfos蛋白表达为16.4%±6.23%，二者相比统计学差异极显著（Plt;0.01）；腹腔内注入茶碱后海马区内cfos蛋白表达为17.3%±9.49%，与注入生理盐水组相比无统计学差异（Pgt;0.05）；注入Ado组cfos蛋白量与注入茶碱组相比，统计学差异极显著（Plt;0.01），表明大鼠腹腔内注入Ado后cfos蛋白表达明显增加，注入茶碱后cfos蛋白表达增加不明显，即Ado促进cfos蛋白表达。见图1。 　 　3 讨论 　　Ado的生理作用广泛，且与其介导的受体有关。Ado受体有A1R、A2AR、A2BR、A3R等几种主要类型，其中在S内具有睡眠调节作用的受体主要是A1R、A2AR〔4〕。实验证明，睡眠剥夺后脑内Ado含量越来越高，一旦进入睡眠状态Ado浓度会很快下降。有研究表明，睡眠剥夺后大鼠前脑基底部细胞外Ado浓度升高，同时伴随着A1R mRNA升高，且在前脑基底部输注Ado可以增加睡眠，说明Ado具有