葛根素通过PI3K-Akt途径对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的抑制.docVIP

　　葛根素通过PI3K/Akt途径对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的抑制 作者：马亚飞 刘新伟 乔欣 王群英 杨海燕 【摘要】 目的 观察葛根素预处理对缺血再灌注(I/R)大鼠心肌细胞凋亡的影响及其与PI3K/Akt信号通路的关系。方法 30只SD大鼠随机分为假手术组(SH组)、缺血再灌注组(I/R组)、葛根素预处理组(PU组)、葛根素预处理+LY294002组(PU+ LY组)及缺血再灌注+LY294002组(I/R+ LY组)。除假手术组外，其他各组大鼠均行结扎冠状动脉前降支30 min，再灌注120 min，监测血流动力学，PTP)的开放等多种抗心肌缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用〔1～3〕，但其机制尚未阐明。由于心肌I/R过程中心肌损伤的发生是多因素多途径的，所以阻断心肌损伤级联反应中关键环节和抑制参与多信号途径的介质是防治心肌损伤和细胞凋亡的最有效方法。磷酸肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K /Akt)信号通路是细胞内重要的信号转导通路，在对抗心肌缺血再灌注损伤、抑制细胞凋亡中发挥重要作用〔4〕。因此，本研究通过复制大鼠心肌I/R损伤模型，探讨葛根素预处理对I/R心肌细胞凋亡的影响及其与PI3K/Akt信号通路的关系。 　 　1 材料与方法 　　1.1 动物及试剂 健康雄性SD大鼠30只，体重250～300 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。葛根素注射液(浙江康恩贝制药股份有限公司，40 mg/ml)、PI3K/Akt 信号通路抑制剂 LY294002(Cell signaling 公司);pAkt(Ser473) 抗体(碧云天);TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。 　　1.2 I/R模型制备 健康雄性 SD 大鼠以 10% 水合氯醛 3～4 ml/kg 作腹腔注射麻醉，将针形电极插入四肢皮下。分离左颈静脉置管用于注药，分离左颈总动脉插入一含 0.1% 肝素生理盐水的导管至左心室，通过 BL410 生物机能实验系统记录心电图和左心室血流动力学变化。气管插管接人工呼吸机作机械通气，沿胸骨左缘第 2～4 肋间隙开胸，自制拉钩拉开肋骨，在左心耳及肺动脉圆锥间找到冠状动脉左前降支(LAD)，在距其起始部 3～4 mm 处用 40 带线缝合针穿过，将一小段聚乙烯管(直径 1.5 mm)置于结扎线下，收紧结扎线以阻断 LAD 血流，阻断 30 min 后，松线再灌注 120 min。以结扎 LAD 后心电图Ⅱ导联 ST 段出现弓背向上抬高，T 波高耸等为缺血成功，放松结扎线后，抬高的 ST 段下降 1/2 以上为再灌注成功。 　　1.3 实验分组 雄性 SD 大鼠 30 只随机分成 5 组，每组 6 只。①假手术组(SH 组)：开胸,在 LAD 下穿线但不结扎，在穿线前 15 min 经左颈静脉缓慢注射生理盐水(2.5 ml/kg)，连续观察 150 min。②缺血再灌注组(I/R 组)：在结扎前 15 min经左颈静脉缓慢注射生理盐水(2.5 ml/kg)， 缺血 30 min，再灌注 120 min。③葛根素预处理组(PU 组)：缺血前 15 min 经左颈静脉缓慢注射葛根素(2.5 ml/kg)，余同 I/R 组。④葛根素 + LY29400组(PU+LY 组)：给葛根素前 15 min 经左颈静脉缓慢注射 LY29400 (0.3 mg/kg)〔5〕，余同 PU 组。⑤I/R + LY294002 组(I/R+LY 组)：缺血前 15 min 经左颈静脉缓慢注射 LY29400 (0.3 mg/kg)，余同 I/R 组。 　　1.4 心功能测定 经 BL410 生物机能实验系统观察缺血前、缺血30 min、再灌120 min 时左心室收缩压(LVSP)、左室内压变化最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。 　　1.5 in后，4℃ 15 000 r/min离心 15 min,取上清，进行Bradford比色法测定蛋白质浓度检测蛋白浓度后分装,于 -80℃冰箱保存备用。20 μg蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，电转膜至 PVDF 膜，5% 的脱脂奶粉室温封闭 1 h，一抗PAKT (1∶500) 4 ℃ 过夜,二抗室温 1 h，并以兔抗鼠 βactin (1∶500) 单克隆抗体同上操作，作为上样对照，化学发光试剂显影,暗室曝光冲片,利用 BioRad 图像分析系统进行条带的分析，将各组 pAKT 密度值分别与 βactin 密度值的比值作为相对表达量，进行统计分析。 　　1.6 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡 再灌注结束后迅速分离心脏,去除心房和右心室，PBS 液冲洗干净，中性甲醛液 4 ℃ 固定 24 h 后制备石蜡切片。按照细胞