血管抑素对糖尿病肾病大鼠MMP2和MMP9表达的影响.docVIP

　　血管抑素对糖尿病肾病大鼠MMP2和MMP9表达的影响 【摘要】 　　目的 探讨腺相关病毒介导血管抑素基因（rAAVAS）对糖尿病肾病（DN）大鼠肾皮质中基质金属蛋白酶2（MMP2）和9（MMP9）表达的影响。方法 采用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射法建立糖尿病动物模型。SD大鼠随机分为对照组、糖尿病组、rAAV空载体组和rAAVAS 治疗 组。第10周检测大鼠的微量白蛋白尿(MAU)及肾脏肥大指数、肾功能、血糖、糖化血红蛋白;免疫组化观察肾皮质内MMP2、MMP9，光镜观察病理变化。结果 治疗组肾皮质中MMP2、MMP9的表达高于糖尿病组,但都低于对照组，免疫组化有相应的改变。结论 rAAVAS对DN大鼠肾脏具有保护作用,其可能机制与其上调大鼠肾皮质中MMP2、MMP9的表达，从而减少肾组织细胞外基质(ECM)的聚集有关。 【关键词】 腺相关病毒介导血管抑素基因；糖尿病肾病；基质金属蛋白酶2；基质金属蛋白酶9 　　糖尿病肾病(DN)本质上就是一种血管内皮紊乱综合征，是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一。肾小球细胞外基质的聚集继而硬化是DN特征性的病理改变〔1〕。肾组织中促使ECM降解的主要生理调节子是基质金属蛋白酶（MMPs），即MMP2、MMP9，它可以降解已知的所有基质成分〔2，3〕。血管抑制素（AS）能够特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增生的因子〔4〕，增加MMP表达，降低DN的蛋白尿〔5〕，发挥肾保护作用。 腺相关病毒介导血管抑素基因（rAAVAS）由于其宿主范围广，免疫原性低,表达携带基因长久等，被广泛用于基因治疗的实验研究 〔6，7〕。本实验旨在探讨rAAVAS对DN大鼠肾皮质中MMP2、MMP9表达的影响及其可能作用机制。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　雄性SD大鼠，体重160～180 g,8周龄，由徐州医学院动物中心提供。免疫组化试剂购于武汉博士德，链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma公司，rAAVAS由本元正阳公司构建。 　　1.2 方法 　　1.2.1 实验分组和模型制备 　　实验动物随机分为对照组（NC组,n=10）；糖尿病肾病组（DN组,n=15）；腺相关病毒空载体组（rAAV0组，n=15）,AS组（rAAVAS，n=15，2×1012 μg/kg），STZ 60 mg/kg)腹腔注射诱导糖尿病模型,72 h后尾静脉测血糖gt;16.7 mmol/L,诊断为糖尿病，并持续1 l经腹主动脉灌注双肾，取肾，去肾包膜滤纸吸干血迹，称肾重(KAU采用放射免疫法检测，HbA1c采用高压液相色谱法检测，BG由罗氏血糖仪及试纸检测，UCr、SCr由OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪检测，并 计算 内生肌酐清除率（Ccr），结果用大鼠体重校正。 　　1.2.4 肾组织病 理学 观察 　　肾组织经10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋,切片厚4 μm，HE染色，光镜下观察肾组织形态学改变。 　　1.2.5 免疫组化 　　采用二步法。4 μm厚石蜡切片常规脱蜡至水，微波加热修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶后,分别滴加兔抗大鼠MMP2（1∶50）、MMP9（1∶50）多克隆抗体，4℃过夜。37℃复温后滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、封片。每张切片在高倍镜下（×200)随机采集10个视野,采用ImageProPlus 6.0图像分析软件测定每个视野中免疫组化阳性表达的积分光密度值(IOD)，然后计算平均值。 　　1.3 统计学处理 　　实验数据以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析。 　 　2 结 果 　　2.1 动物一般情况观察 　　NC组大鼠毛发光泽，饮食正常，垫料5 d换一次;DN组及rAAV0组毛发枯黄，明显消瘦、多尿、多饮、早期多动，后期反应迟钝、动作迟慢、多汗、毛竖无光泽、小便量多，垫料1～2 d换一次； AS组饮食较DN组及rAAV0组明显改善，但不如正常组大鼠。表1 各组BAU、BG、HbA1c的影响 　　与NC组比较，DN组及rAAV0组BG、HbA1c、Cr、MAU明显升高（Plt;0.05）。AS组Cr、MAU、 BG、HbA1c较DN组及rAAV0组降低（Plt;0.05），但DN组与rAAV0组间BG、HbA1c无统计学意义（Pgt;0.05），见表2。表2 各组BUN、Cr、24 h MAU、BG、HbA1c的变化(略) 　　2.4 免疫组化结果 　　NC组中MMP2、MMP9在肾小球及肾小管中均有微量表达,DN组及rAAV0组的表达则明显减弱（Plt;0.05）,且主要在肾小管上皮细胞，而AS组的表达较DN组