西罗莫司高产突变株FC904.docVIP

　　西罗莫司高产突变株FC904 作者：黄捷 金东伟 余辉 程元荣 【摘要】 西罗莫司是吸水链霉菌FC904产生的新型强效免疫抑制剂。为了获得高产西罗莫司突变株，采用UV、硝苯胍和甲基磺酸乙酯诱变剂诱变处理吸水链霉菌FC904的孢子悬液和发芽孢子，随后用西罗莫司对存活菌株进行自身代谢产物的耐受性试验，获得西罗莫司高产突变株FC904-33，其生物合成能力是原出发菌株的4.6倍。本文报道该突变株的培养特征、对抗生素的敏感性、西罗莫司生产能力和副产物等。 【关键词】 西罗莫司； 诱变育种； 生物合成 ABSTRACT Sirolimus, a pomunosuppressant, is produced by Streptomyces hygroscopicus FC904. In an attempt to improve its production, mutation and screening ing buds ethane sulfonate (EMS), some of survivors us. A mutant FC904-33 us utant such as fes; Mutagenesis; Biosynthesis 西罗莫司(sirolimus)原名雷帕霉素(rapamycin)，是吸水链霉菌产生的具独特作用机制的含氮三烯大环内酯化合物，具有抗真菌、抗增殖和抗肿瘤活性的新型强效免疫抑制剂。由于其特异地结合并抑制哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(manmalian target of rapamycin，mTOR)的作用，已被用作器官移植抗排斥药物、自身免疫性疾病 治疗 药［1］，临床心血管支架涂料；西罗莫司及其的衍生物CCI-779、AP23573和RAD001正开发为靶向、低毒的抗肿瘤药物［2］。在生产过程中，西罗莫司菌种的生产能力是关键。本文报道应用物理、化学诱变因子联合诱变西罗莫司产生菌吸水链霉菌FC904［3］孢子悬液和发芽孢子，存活株再行对其自身代谢产物西罗莫司耐药性选择和营养代谢研究，获得突变株33#以及突变株33#的培养特征、抗生素敏感性及发酵调控。 　　1 材料与方法 1.1 菌种 西罗莫司产生菌吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopcus)FC904，福建省微生物研究所保存，作为诱变育种的出发菌株。 1.2 培养基及培养条件 (1)琼脂斜面培养物 琼脂斜面培养基为燕麦片琼脂(ISP3)；自吸水链霉菌FC904沙土保存管中取出少许保存物或自生长好的琼脂斜面取出一环培养物接种于ISP3琼脂斜面上，28℃培养15～20d，斜面表面培养物出现吸水黑斑，4℃保藏备用。 (2)种子培养 吸水链霉菌FC904孢子接种于种子培养基(主要成分有葡萄糖，酵母浸膏、蛋白胨等，pH7.0，500ml三角瓶装80ml培养基)，28℃、220r/min振荡培养36～48h。种子瓶外观浓稠， 显微镜观察菌丝呈网状，可作为移种的种子。 (3)发酵 3～6ml的种子培养物移入60ml发酵培养基中(主成分为：葡萄糖、淀粉、黄豆饼粉、蛋白胨等，pH6.0，三角瓶500ml)，28℃、220r/min振荡培养84～96h，进行效价测定。 1.3 西罗莫司的检测 (1)标准品 西罗莫司标准品由福建省微生物研究所制备，经 中国 药品生物制品检定所标定，纯度99.8%。 (2)发酵液提取 发酵液经甲醇提取后［2］进行生物效价测定和/或HPLC检测。 (3)生物效价检测 生物效价检测采用纸片半固体琼脂扩散法［3］。 (4)HPLC检测 HPLC检测采用外标法。HPLC检测仪：Beckman System Gold，色谱柱：ODS C18，流动相：甲醇∶水(75∶25)，检测波长277nm，柱温40℃。 西罗莫司效价=标准品浓度×样品积分面积(tran+cis)×进样体积/标准品积分面积(tran+cis)×进样体积 1.4 物理、化学诱变因子联合处理吸水链霉菌FC904 (1)UV和NTG联合处理吸水链霉菌FC904孢子 10ml孢子悬液置于9cm直径的培养皿中，在暗环境下经30距离照射10s后，再用NTG 3mg/ml(0.1mol/L Tris·Cl pH8.0缓冲液配制)28℃避光处理2～3h。终止反应后，孢子悬液重新悬浮于生理盐水中，稀释并涂布在ISP3琼脂平板上，28℃培养10～15d。 (2)EMS处理突变株27#发芽孢子和西罗莫司抗性菌株的筛选 将处理获得的突变株27#孢子接种于发芽培养基(葡萄糖1%，酵母浸膏0.6%，蛋白胨0.6%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH7.0，250ml三角瓶装30ml培养基)，28