质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性.docVIP

　　质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性 作者：郭敏，郎明健，曾秋棠，杨汉东，闵新文 【摘要】 目的： 探讨 应用 阳离子脂质体lipofectamine2000在体转染质粒重组体基因至大鼠心肌的可行性. 方法 ： 构建含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的真核表达质粒. 将 22只雄性SD大鼠随机分为4组：阴性对照组（Ⅰ组，n=4），心肌注射组（Ⅱ组,n=6），尾静脉注射组(Ⅲ组，n=6)和冠状动脉灌注组（Ⅳ组，n=6）.分别采用心肌局部注射、尾静脉液压注射、冠状动脉灌注三种不同方式实施在体心肌转染. Ⅱ～Ⅳ组于转染后2，14 d时间点各随机处死3只大鼠，阴性对照组各处死2只大鼠,取心肌组织作快速冰冻切片，荧光显微镜下观察EGFP表达情况. 结果： 在荧光显微镜下观察EGFP表达情况，阴性对照组隐约可见淡绿色荧光，第2天各转染组均可见明显的绿色荧光分布于所取心脏组织. 各转染组荧光强度与阴性对照组相比,其差异均有统计学意义(Plt;0.05).心肌注射组和尾静脉注射组间荧光强度差异无统计学意义（P=0.17）. 冠状动脉灌注转染组荧光强度较其余两组增强7.37倍（P=0.013）. 第2周转染各组荧光强度明显减弱，与阴性对照组差异无统计学意义(P=0.41). 结论： 阳离子脂质体lipofectamine2000可有效的将质粒重组体通过各种方式转染心肌组织，而通过冠状动脉灌注转染可以明显提高其转染效率. 【关键词】 脂质体；心肌；转染；质粒；绿色荧光蛋白质类 0引言 　　基因 治疗 为心血管疾病的治疗带来了新的希望［1］，如何高效、稳定、安全地将目的基因转染到心肌组织是基因治疗中的关键 问题 . 目前 ，外源基因导入哺乳动物细胞的方法大致有生物方法和物理化学方法2种. 前者主要以病毒为载体，外源基因在宿主细胞中能长期表达，属当前基因治疗中首选的基因转染方式，但其安全性差、缺乏靶向性等缺点使其应用受到很大限制. 后者包括磷酸钙法、显微注射、电穿孔等,因其操作方法限制，不适于大量细胞的转染及基因治疗的在体 研究 ［2］. 阳离子脂质体是一种非病毒制剂，由于其具有转染效率相对较高、操作简易、可大规模转染及不引起特异性免疫反应等优点受到大家的关注. 本研究应用阳离子脂质体lipofectamine2000将质粒重组体通过局部心肌注射、尾静脉注射、冠状动脉灌注转染3种途径转染至心肌组织，并比较其转染效率，为今后进行心肌组织在体转染的研究提供方法学 参考 . 1材料和方法 1.1材料SD雄性大鼠22只，体质量 150～200 g,购自华中 科技 大学同济医学院实验动物中心. pGenesil1质粒及感受态细胞DH5а购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司，lipofectamineTM2000及OMEM培养基购自Invitrogen. 1.2方法 1.2.1pGenesil1质粒重组体的构建质粒重组体pGenesil1的构建参考 A：阴性对照组；B：心肌注射组；C：尾静脉注射组；D：冠状动脉灌注转染组；E：冠状动脉灌注转染组升主动脉. 图1转染2 d时各转染组EGFP的表达×100 A：阴性对照组；B：心肌注射组；C：尾静脉注射组；D：冠状动脉灌注转染组；aPlt;0.05 vs阴性对照组; bPlt;0.05 vs心肌注射组和尾静脉注射组. 图2各转染组平均荧光强度比较 最初基因 治疗 的途径集中于局部注射于靶器官. 早在1990年，alone, RS, Morle G, et al. Expression of rebinant genes in myocardium in vivo after direct injection of DNA［J］. Circulation, 1990, 82(6): 2217-2221. ［9］ Liu D, Knapp JE. Hydrodynamicsbased gene delivery［J］. Curr Opin Mol Ther, 2001 ,3(2):192-197. ［10］ Budker V， Budker T， Zhang G, et al. Hypothesis: naked plasmid DNA is taken up by cells in vivo by a receptormediated process ［J］．Gene Med, 2000,2(2)：76-88. ［11］ Miao ol Cell Cardiol, 2000, 32(12):2397-2402. ［12］ Lee LY, Patel SR, Hackett NR, et al. Focal angiogen therapy using i