质粒小提2011–3–24.docVIP

TM 上海莱枫生物科技有限公司 网址： 订货电话：021 传真：021技术解答：shanghai@ 技术支持：400-600-1087上海) 质粒DNA 小量提取试剂盒 一、产品简介 采用SDS碱裂解法，结合硅胶膜选择性吸附DNA的方法，适合从1-4ml细菌培养物中提取多至20 μg质粒DNA。纯化的质粒DNA 适合用于酶切、PCR、测序、转化和转染等分子生物学实验。 本试剂盒改进了裂解条件(Buffer P2)，避免菌量极少时或者菌液过度老化时可能出现的单链质粒DNA；优化了中和环境 (Buffer P3)，提高裂解速度，能最大程度释放质粒DNA，并且减少因为机械力损伤的原因造成的基因组DNA污染和质粒DNA断裂。 二、试剂盒组成和储存 组成内容 DK301-01 (50次) DK301-02 (200次) RNase A1＊ 30 μl 120 μl Buffer P1 15 ml 60 ml Buffer P2 15 ml 60 ml Buffer P3 20 ml 80 ml Buffer WA§ 19 ml 75 ml Buffer WB§ 16 ml 65 ml DNA吸附柱-B 50个 200个 收集管 50个×2 200个×2 1.5 ml离心管(用于洗脱) 50个 200个 TE※ 15 ml 30 ml 说明书 1份 1份 ＊RNase A1: 50 mg/ml, -20℃长期保存；第一次使用前将RNase A1全部加入Buffer P1中，于4℃保存。 §Buffer WA和Buffer WB，第一次使用前按试剂瓶所示体积加入无水乙醇或者95%乙醇，混合均匀。 ※TE：10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0(25°C)。 除RNase A1和Buffer P1(已加入RNase A1)外，其他组成成分于室温储存。 三、注意事项 1. Buffer P2、Buffer P3和Buffer WA含刺激性化合物，避免沾染皮肤、眼睛和衣服、谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛，立即使用大量水或生理盐水冲洗沾染处，必要时寻求医疗咨询。 2. 每次使用后应及时盖紧试剂瓶盖子，以免影响下次使用效果。 3. 操作步骤2，充分悬浮细菌，无可见的块状菌团，不然会影响裂解效果。 4. 操作步骤3，缓慢翻转离心管，避免机械力打断基因组DNA而导致最后纯化的质粒DNA中有基因组DNA污染，同时避免打断质粒DNA，保持其完整性。 5. 操作步骤3，菌量极少或者菌液过度老化时(培养时间过长或者放置时间过长)，溶液迅速呈透亮状后，需立即加入Buffer P3，避免质粒DNA长时间暴露于Buffer P2（强碱性环境）中完全变性为单链DNA后，无法恢复为超螺旋结构。 6. 操作步骤4，形成紧实的(不粘稠的)凝集物前需缓慢摇晃离心管，避免机械力打断基因组DNA和质粒DNA；形成紧实的凝集物后，基因组DNA被包裹进入凝集物，质粒DNA恢复超螺旋结构，快速剧烈摇晃3次不会打断基因组DNA和质粒DNA。快速剧烈摇晃3次的目的是将凝集物打散有利于离心沉淀去除，并且将凝集物中包裹的部分质粒DNA释放到溶液中。 7. 操作步骤10，加入洗脱液后室温放置1-2 min或者更长时间，有助于提高DNA洗脱效率，从而提高产量。 8. 操作步骤10，如果离心机转子没有盖子或者使用气密型盖子，在将1.5ml离心管盖子扣在DNA吸附柱上后，务必去除DNA吸附柱的盖子(剪掉或者拧断，见2图示)；因为高速离心时未扣在DNA吸附柱上的盖子容易脱落，造成安全隐患。 9. 操作步骤6为可选步骤。Buffer WA能有效去除可能残留的蛋白，并且能去除大部分内毒素；使用核酸酶含量丰富的菌株(如JM系列和HB101)扩增质粒DNA或者提取的质粒DNA用于转染，需要操作此步骤。 四、实验准备 1. 第一次使用前，将试剂盒携带的RNase A1全部加入Buffer P1中。 2. 第一次使用前，按试剂瓶所示体积在Buffer WA和Buffer WB中加入无水乙醇或者95%乙醇，混合均匀。 3. 每次使用前，检查Buffer P2是否析出白色或者晶体状沉淀，如有沉淀在37℃放置数分钟，沉淀溶解后恢复至室温(约20min)后使用。 五、操作步骤（所有离心操作均为室温12,000×g） 细菌收集、裂解和中和 1. 用干净的1.5 ml离心管，离心30秒，收集1-4 ml细菌培养物中的细菌；弃尽上清。 ▲收集细菌后，样品数量较少时，建议简短离心，吸除上清；样品数量较多时，建议将离心管倒扣在吸水纸上