Western_blot实验步骤.ppt

Western blot 实验技术 Western blot 原理 Western Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳分离蛋白质混合物，经过SDS分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。 由于Western blot检测技术具有简便，快捷等特点，所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。 Western Blot 信号放大基本原理 经过SDS分离的蛋白质、多肽等被转移到固相支持膜上，然后用蛋白质或多肽特异性的抗体来检测 Western Blot一般流程 Western Blot基本实验步骤 1、蛋白质提取：WIP或RIPA裂解细胞或研磨组织，离心，收集上清。 2、蛋白定量：先总蛋白定量，western后在依据内参定量。 3、电泳：依据需要检测蛋白的分子量选取胶的浓度，制胶，电泳。 4、转膜：半干或湿转，应用半干法转膜需防止短路。 5、封闭：5%脱脂奶粉或BSA封闭过夜或室温1小时。 6、一抗孵育：5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时或4度过夜，1x TBST洗膜3次，每次5分钟。 7、二抗孵育：5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时， 1x TBST，洗膜3次，每次5分钟。 8、显影(ECL法)：将A、B发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。 9、图片分析：标定Marker，进行分析与扫描 。 蛋白样品的制备 贴壁细胞：细胞可以在培养皿里裂解，洗掉培养基，PBS洗2~3次，加入RIPA裂解液裂解，以可以将细胞消化下来，离心，PBS洗2~3次，加入RIPA冰上裂解液裂解30分钟（可提高蛋白浓度）。按6孔板100-200微升/孔的比例加入PIPA(可根据细胞多少调节裂解液体积）, 4度，12000转，离心15分钟，收集上清. 悬浮细胞: 收集培养细胞，离心去除培养液，用PBS洗2-3遍，按6孔板加入100-200微升/孔的比例加入RIPA，用抢悬浮细胞。如果细胞数量较大，应按50-100万细胞/管分装或根据细胞数量按比例增加RIPA的用量，裂解完全时应无明显的细胞颗粒。4度，12000转，离心15分钟，收集上清. 组织样品：液氮研磨组织，按每20毫克组织加100-200微升的比例加入RIPA,冰上裂解30分钟，4度，12000转，离心30分钟，收集上清. 蛋白样品的定量 Bradford法测定蛋白浓度 原理：此法基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在595nm处有最大光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。 考马斯亮兰溶液的配制：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%(W/V)磷酸，将溶液用水稀释到1000mL，过滤。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G250，4.7%(W/V)乙醇，和8.5%(W/V)磷酸。 实验步骤：96孔板，对照20μl PBS,测定蛋白样品:18μl+2μl蛋白，加入200μl考马斯亮兰溶液，放置2分钟（在一个小时内测，时间变长，可能会产生沉淀），酶标仪上595nm处测定吸光值，这样只能相对定量蛋白，如果要定量蛋白，可以用不同梯度的BSA做标准曲线来定量蛋白 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： SDS 是一种阴离子表面活性剂.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS后,由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳注意： （1）所有蛋白样品定量一致，体积以一致，不够的用裂解液补满，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积，这样可以避免最边上的孔道电泳时出现扩散，使最边上的孔道