低氧反应通路对骨髓基质干细胞多向分化能力的影响.pdfVIP

上海交通大学医学院硕士论文 灭菌双蒸水，溶解后分装冻存。提前将水浴调至55℃备用。 4.2 、样品准备： 分别从4 周龄标记鼠（HIF-1αflox/flox 、VHLflox/flox ）尾部末端切取1cm 的组织，在液氮中将组织充分研磨成粉末，并转移至1.5ml 的离心管中。 4.3 、抽提步骤： 4.3.1 、加入180ul Digestion Buffer和20ul Proteinase K ，震荡混匀1min， 置于55℃温浴1h，充分混匀，直至充分溶解； 4.3.2 、加入200ul BDBuffer ，充分混匀； 4.3.3 、加入200ul 无水乙醇，充分颠倒混匀； 4.3.4 、将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮 物全部加至吸附柱中，静置2min ，12000rpm 离心3min，倒掉 收集液中的废液； 4.3.5 、将吸附柱放回收集管中，加入500ul PW Solution，10000rpm 离 心30sec，倒掉收集管中的废液； 4.3.6 、将吸附柱放回收集管中，加入500ul Wash Solution，10000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液； 4.3.7 、将吸附柱放回收集管中，10000rpm 离心2min ； 4.3.8 、将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中，在吸附膜中央加入50ul 预热(60℃) 的Elution Buffer ，静置5min，10000rpm 离心1min， 将所得到的DNA 溶液置于-20 ℃保存用于后续试验。 5、 鼠尾基因鉴定： 5.1、聚合酶链反应： 5.1.1、引物合成 由美国阿拉巴马大学Clemens 教授提供引物序列，委 托上海Invitrogen 公司合成（表2 ）； 10 上海交通大学医学院硕士论文 表2 ：定量PCR 引物序列 Table 2: Primers for QRT-PCR 目 的 产物大小 退火 循环 引物序列 基因 温度 数 HIF 5’-TGATGTGGGTGCTGGTGTC-3’ 312bp wild 57 30 5’-TTGTGTTGGGGCAGTACTG-3’ 350bp flox VHL 5’-CTAGGCACCGAGCTTAGAGGTTTGCG-3’ 250bp wild 58 30 5’-CTGACTTCCACTGATGCTTGTCACAG-3’ 450bp flox TSH 5’-TCCTCAAAGATGCTCATTAG-3’ 386bp 53 30 5’-GTAACTCACTCATGCAAAGT-3’ OST 5’-CAAATAGCCCTGGCAGAT-3’ 300bp 53 30 RBG 5’-TGATACAAGGGACATCTTCC-3’ 5.1.2、取提取的DNA ，以此为模板进行PCR 反应，反应体系见（表3、4 ）： 表3 ：PCR 反应体系(VHL 、HIF) 反应物