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蛋白质的Western印迹分析 刘二战 一、原理 二、方法 三、样品蛋白的制备 三、样品蛋白的制备 三、 样品蛋白的制备 三、样品蛋白的制备 三、 样品蛋白的制备 三、 样品蛋白的制备 三、 样品蛋白的制备 三、 样品蛋白的制备 三、 样品蛋白的制备 三、 样品蛋白的制备 四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉 四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉 四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉 四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉 四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉 四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉 四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉 四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉 四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉 五、转膜 五、转膜 五、转膜 五、转膜 五、转膜 五、转膜 六、检测 六、检测 六、检测 六、检测 请批评指证谢谢 * * 一个基因表达的最终产物是产生相应的蛋白，因此检测蛋白是测定基因表达的主要标志。 原理：Western Blotting 是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离；并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜进行杂交，使其与膜上的靶蛋白特异性结合；再与经辣根过氧化物酶标记的二抗结合，最后用ECL试剂反应，经X线片曝光、显影等一系列反应，检测蛋白质等生物大分子。 样品蛋白的制备 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳 转膜 检测 1、原理： 蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理只有两个方面： 一是用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等； 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使备组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。 2、蛋白质制备的步骤 （1） 选择材料和预处理 （2）细胞的破碎及细胞的分离 （3）提取和纯化 （4）浓缩、干燥和保存 3、培养细胞中蛋白质样品的提取 提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理，在提取蛋白质的实验中要考虑到细胞裂解液的pH、去污剂的类型和浓度，以及二价阳离子、辅助因子等因素，同时为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解，需在裂解液中加入蛋白酶抑制剂。 3.1 实验材料 （1）器材： 冷冻离心机， 细胞刮，Tip头、1.5ml、 0.5ml 灭菌Ep管，碎冰。 （2）试剂： ① 细胞总蛋白裂解液（100ml）: 1×PBS 80ml，Triton-100 1ml, 去氧胆酸钠0.5g, SDS 0.1g, 补 1×PBS缓冲液至100ml。 ② PMSF贮存液（PMSF 17.4mg/异丙醇）： PMSF（苯甲基磺酰氟）在水溶液中不稳定，应在临用前向不含PMSF的裂解缓冲液中加入PMSF贮存液100ul,使其终浓度为0.174mg/ml。 （3）Hela 细胞 3.2 实验方法 （1） 洗涤细胞：选取细胞培养皿中培养的Hela细胞，由37℃取出后放入冰盘中，预冷。吸弃原培养液，用4 ℃预冷的1×PBS洗细胞表面3～4次，除净培养基中的血清，并尽量吸弃细胞培养皿中残余的PBS。 （2） 向培养皿中加入蛋白裂解液(100ul/60mm)，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面。 （3） 冰浴30～60min，期间晃动3～4次。 （4） 用细胞刮子集中裂解液，收集入冰上预冷的1.5ml Ep 管中， 4 ℃离心，12000g 20min. （5） 小心吸取上清液入新的预冷管中（为避免反复冻融导致蛋白降解，可按需要将其分装使用），-80 ℃保有存备用（可保存1年） 3.3 注意事项 （1） 注意个人防护：PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼晴或皮肤接触了PMSF，立即用大量清水冲洗。 （2） 设立必要实验对照。 （3） 为防止蛋白降解，上述操作全部应在冰上完成。 （4） 所用离心机需要提前预冷。 （5）可于显微镜下观察细胸裂解的程度。 （6）吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。 4、蛋白质的浓度测定——考马斯亮蓝蛋白定量法 考马斯亮蓝 G－250 法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。 4.1 原理 考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在 488nm；当它与蛋白质结合后变为青色， 蛋白质-色素结合物在 595nm