任课教师蔡智贤.doc

??????????????????????????????? 任課教師:蔡智賢 　 學號： 　 姓名: 　 一、題目：葉綠素的吸收光譜與定量測量。 二、實驗日期： 年 月 日；第 組。 三、實驗目的： ??? 利用有機溶劑抽取葉綠素，並測定葉綠素吸收光譜及學習測定葉片中的葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b含量的方法。 四、實驗原理： ??? 根據Arnon於1949、1956年報導，利用公式分別求出每單位葉片組織中，各種葉綠素的含量。 五、材料與方法： 材料與藥品： 酢醬草葉 數片 丙酮 (80% acetone) 50 mL 海砂 適量 光電比色計(光譜儀) 1台 磨缽 1組 光電比色管 2支 拭面紙 1盒 打孔機 1台 三角瓶 1個 離心機 1台 離心試管 3支 棕色定量瓶 3支 石腊膜 1卷 　 　 實驗方法： 一、色素抽取：(必須在低溫黑暗的環境中操作) 1. 用打孔器打下15片葉圓片。 2. 取5片葉圓片稱其重量(要把重量記錄下來)，然後置於磨缽中，共取3次。 4. 加3 mL 80%丙酮混合海砂、葉圓片一起磨碎成漿狀。 5. 加入2 mL 80%丙酮稀釋後，倒入離心試管中。 6. 再用2 mL 80%丙酮清洗磨缽中的葉綠素，再倒入離心試管中，如果沒有完全洗下葉綠素的話，最多再用2或2.5 mL 80%的丙酮把磨缽上的葉綠素洗下，因為丙酮總體積不得超過10 mL。 7. 用石腊膜將離心試管口封起來(註：三支離心試管內的液體若不等高，則以最高者為準，其他兩支各加丙酮到三支離心試管內的液體都同高)。 8. 以2500 rpm離心10 min(離心時會因不穩而變換數字)。 9. 將濾出的綠色溶液盛於棕色定量瓶中(不要倒入沉澱物)，並加蓋以免揮發。 10. 在棕色定量瓶內加入80%的丙酮到瓶上的白線位置，定量總體積為10 mL。 二、葉綠素的定量： 1. 先用80%的丙酮溶液調節零點(放入裝有80%丙酮溶液的光電比色管於光電比色計對照的位置，然後按Zero)。 2. 取少許葉綠素抽出液清洗另一支光電比色管。 3. 取3~4 mL葉綠素抽出液盛於光電比色管中。 4. 測量在波長為663 nm、645 nm時的吸光值(A)。 5. 計算每1g酢醬草葉片組織中所含葉綠素的量，葉綠素的含量可用下列公式 求出： 葉綠素a (mg/gFW)? = [12.7×(A663)–2.69×(A645)]×V/(1000×W) 葉綠素b (mg/gFW)? = [22.9×(A645)–4.68×(A663)]×V/(1000×W) 葉綠素總量(Tchl)(mg/gFW)? = [20.2×(A645)+8.02×(A663)]×V/(1000×W) 葉綠素a/b=葉綠素a/葉綠素b 註： A663 ：葉綠素抽取液在波長663 nm的吸光值 V：葉綠素80%丙酮抽出液的總體積 (mL) W：葉片組織的鮮重量 (g) Tchl：葉綠素總含量 三、葉綠素的吸收光譜： 1. 用U-2000光電比色計測量葉綠素丙酮溶液的吸光度，用80%丙酮溶液調零點。 2. 每隔50 nm波長測一次，自400 nm開始測到800 nm為止，結果以波長為橫軸，吸光值為縱軸，繪成圖表。 六、結果： V = 10 mL 1.原始數據： 重複次數 重(g) A663 A645 重複1 　 　 　 重複2 　 　 　 重複3 　 　 　 (下表數據皆取至小數點後第2位，第3位四捨五入。) 重複次數 葉綠素a 葉綠素b 總葉綠素 葉綠素a/b mg/gFW 重複1 　 　 　 　 重複2 　 　 　 　 重複3 　 　 　 　 平均值±誤差 　 　 　 　 2. 葉綠素的吸收光譜： 　 　 　 七、討論： 1. 試述葉綠素的吸收光譜的特點及生理的意義。 2. 試舉例說明還有那些方法可測定葉綠素含量？ 3. 類胡蘿蔔素如何保護葉綠素的作用？ 4. 葉綠素的螢光反應呈什麼顏色？ 八、結論： 　 1. Arnon, D., M. Allen, and F. Whatley 1954 photosynthesis by isolated Chloroplasts. Nature 174 : 394. 2. Arnon, D. 1967 Photosynthetic phosphorylation. Facts and concepts. In Goodwin T. W.(ed.) Biochemistry of Chloroplast. New York. Academic Press. 3. 王月雲、陳是瑩、童武夫。1996。植物生理學實驗