天女木兰组培实验.docxVIP

天女木兰组织培养研究天女木兰组织培养存在繁殖系数低、褐化及生根难等问题。如何克服褐化成为天女木兰组织培养快速繁殖成功与否的关键之一，而关于天女木兰组织培养快速繁殖中的褐化问题研 究较少。从外植体类型、外植体预处理方法、培养基类型、抗褐化剂类型及培养条件等方面研究了天女木兰（Magnolia sieboldii K.Koch）组织培养过程中的问题。外植体的取材部位：分别选择处于生长阶段的幼嫩侧芽、顶芽、半木质化的天女木兰枝条、叶片。（有研究称侧芽褐化率相对较低，其次是顶芽，带芽的茎段褐化率最高。）在切取外植体时，伤口面积越小，表面消毒剂对外植体伤害越少，褐变越轻 。2、外植体灭菌处理方式：将材料置于流水冲洗2h,放在洗洁精溶液中浸泡5～10min, 再用清水冲洗干净, 然后在超净工作台上用质量分数为2%的次氯酸钠消毒 5～15min, 最后用无菌水冲洗 6次。天女木兰芽在接种前采用1 g／L PVP浸泡 4 h ，抗褐化。3、培养基：适宜侧芽分化的培养基为 :B5+0.5 mg/L 6 BA+0.3 mg·/L IBA另外一组培养基为：1/2 MS+0.5 mg/L 6 BA+0.3 mg·/L IBA适宜生根的培养基为 :1/2 MS+1.0 mg/LIBA+0.5 mg/L NAA低浓度的 BA 能有效地促进愈伤组织的分化与生长。高浓度的BA则产生丛生芽增殖效果较好。（此外，DA-6 这种新型植物活性剂也被应用到天女木兰的组织培养中，对生根效果较好。）培养基中添加 0. 9% 琼脂（天女木兰组培试验中发现 , 琼脂含量低则玻璃化现象严重 。把琼脂含量从 0. 6 %提高到 1. 0 %后 , 不仅能有效防止玻璃化现象的发生 , 而且提高了外植体的增殖倍数）, 3% 蔗糖（适当提高培养基中蔗糖含量 , 降低培养基中的渗透势，可以降低污染率 , 有助于外值体对营养的吸收）, pH = 5. 6～6.0（大多数木本植物要求 pH 值在5. 0～6. 0 。pH 值对外值体成活的影响也十分明显。天女木兰组织培养的最适 pH 值为 6. 0 , 此时的外值体的长势最好，成苗率达到最高）。加入量为 0. 5 g/ L 的PVP（抗褐化效果是聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）＞维生素 C（VC）＞活性炭（AC））。 121 ℃下灭菌 20 min 。4、接种操作： 先剪去茎段两端约 1cm 的部分和叶柄 , 然后把茎段切成小段 , 每个 0.5~1 cm，竖直插入培养基 , 每瓶接种 1 个茎段 。5、培养条件：培养温度 25 ℃ , 光照强度 1 500 lx, 光照时间 10～12 h/d。培养初期一定的低温和暗培养可以减轻天女木兰的褐化。6、继代增殖培养：将诱导分化的无菌苗每隔 40 d转接到新的培养基即 : B5 + 0.5mg· L-1 6 - BA+ 0. 3 mg· L-1 IBA, 经过继代培养 , 培育出无菌苗。7、生根培养：将继代增殖的无菌苗接种在4种生根培养基即R1: 1 /2 MS+2. 0 mg· L-1 IBA +0. 2 mg· L-1 NAA; R2: 1 /2MS+2. 0 mg· L-1 IBA + 0. 5 mg· L-1 NAA; R3 : 1 /4 MS + 0. 5mg· L-1 IBA+ 0. 2 mg· L-1 NAA; R4: 1 /4 MS + 1. 0 mg· L-1IBA+0. 5 mg· L-1NAA, 其结果未见生根。但将1年生实生苗直接接种在R4培养基中，90 d开始生根，根粗壮 , 生根率达到70%。8、驯化与移栽：打开培养瓶的瓶盖 , 将生根的组培苗在培养室中放置 3 d后 , 用镊子将组培苗取出 , 洗去粘附在根部的培养基 , 移栽到基质中。基质用质量分数为 0. 3%KMnO4 溶液喷洒消毒 , 移栽后温度保持在18 ～ 20 ℃ , 相对湿度在 90% 左右 , 炼苗过程中逐渐增加光照强度。2周后长出新的不定根、新叶。以 V(苔藓 )∶V(蛭石 ) = 1∶1 为基质 , 移栽成活率最高达 85% 。9、愈伤组织及胚状体的培养：在木本植物中,具有再生能力的愈伤组织主要由胚外植体得到 , 而其它部位获得的愈伤组织再生能力极低,这一直是木本植物利用组织培养技术进行植物改良和植物繁殖的一大障碍。天女木兰愈伤组织起初都具有胚胎(或器官)发生潜力,但经过反复继代和保存之后 , 这种形态发生能力下降,有时甚至完全丧失 ,很难通过继代培养分化形成优良株系。胚状体的发生方式有 2 种 : 一种是从培养中的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚 ; 另 一种是外植体先愈伤化,然后由愈伤组织细胞分化成胚。这两种方式中，从愈伤组织产生胚状体最为常见。在天女木兰组织培养中，胚状体难以成株 , 限制了