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RNA干扰研究进展 谢克亮1 王世平1 赵长安2 (1新乡医学院本科2001级一部，2新乡医学院生物化学教研室 河南 新乡 453003) RNA干扰（RNA interferenceRNAi）现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double-stranded RNAdsRNA)在细胞内特异地降解该mRNA，从而致使特异性的基因有效封闭的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默post-transcriptional gene silencing，PTGS)。RNAi现象已在不同种属的生物体中发现，下面对RNAi的作用机制、作用特点和应用研究进展作一综述。 1. RNAi的作用机制1.1 RNAi发生的分子机制i的详细机制和过程还不十分清楚，目前大致分为以下几个阶段进行：①siRNA的形成阶段：此阶段需要Rde-1,Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别外源dsRNA引导dsRNA与Dicer结合后Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21-25 nt大小的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。Dicer定位于胞浆中但核内mRNA剪切修饰后在向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21-25nt大小并在3′端带有2-3个碱基悬端5′端磷酸化的siRNA诱导RNAi效应最强Dicer家族在进化上非常保守，有5个组成部分：N-端RNA解旋酶结构域、1个PAZ结构域(Piwi，augonaute，Zwille/pinehead，PAZ)、2个 RNaseIII结构域和C端dsRNA结合基序Dicer在体内一般是以二聚体的形式发挥作用的由于不同种族Dicer分子大小不一样，所以dsRNA被切割成siRNA大小具有种族差异 []。② RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silicencing complexRISC）形成阶段：生成siRNA和RNAi特异性酶如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC，具有序列特异性核酸内切酶，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA③效应阶段[2]： siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶（如qde-3，mut-6，mut-14）的作用下使siRNA链解离，使RISC由250kD大小的前体形式变成约100kD左右活性形式，解旋酶催化mRNA与siRNA的正义链相互交换核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5′起始端下游710个核苷酸处切断mRNA。④扩增阶段：该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为摸板，在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变dsRNA。RdRP还是一个重要的“sensor”，它能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都是在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程[3]。此外RNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制：①Dicer将长dsRNA切成初级siRNA ，这放大水平取决于dsRNA的长度；②siRNA在酶的作用可以多次应用，进一步的放大效应。 1.2 RNAi的特点 ①高特异性有时siRNA一个碱基改变就会大大降低封闭靶基因的效果。Brummelkamp[4]等利用载体表达的小发夹RNA （small hairpin RNA，shRNA）来封闭人MCF-7细胞的CDH1基因，shRNA上仅一对碱基的突变就不能抑制CDH1基因的表达。siRNA的中央位置碱基位点3′末端倒数第二个碱基起了格外重要的作用。②高效率[1]：在细胞内RNAi途径一旦被启动，反应信号就被放大。有人认为每个细胞一份拷贝的dsRNA就可以封闭基因的效果。③高成功率：RNAi已被用于线虫全基因组的功能分析其中有50%-80%序列选择有效，12.9%-27%的基因封闭产生了明显的异常表型。④：Irie[5]，RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，一般注入dsRNA后的2-3天，RNAi的作用最明显，后1-2天内，靶mRNA的丰度就能恢复到注射RNAi之前的水平。由于RNA脱氨基活性的逐步增高导致siRNA的生成减少而受到抑制。⑤dsRNA的长度限制性[6]：引发有效RNAi的dsRNA最短不得短于21ntDicer能与200500nt范围内的dsRNA结合，底物片段越短，Dice