P物质对大鼠垂体前叶细胞游离Ca2+影响的研究.docVIP

　　P物质对大鼠垂体前叶细胞游离Ca2+影响的研究 【摘要】 　　目的：探讨SP是否影响培养的大鼠AP细胞［Ca2+］i，在第二信使信息转导途径上进一步阐述SP产生生物学效应的机制。方法：原代培养成年雌性S-D大鼠的AP细胞48h，加入SP孵育不同时间，采用Fura-2/AM检测［Ca2+］i。结果：当SP浓度为100nmol/L，孵育时间由10min增加到30min时［Ca2+］i增加，但孵育时间为40min、50min时，［Ca2+］i呈现减少趋势，即最大反应的孵育时间为30min。当孵育时间为20min、30min、40min、50min时，［Ca2+］i分别为211±16nmol/L、369±51nmol/L、358±24nmol/L、239±36 nmol/L，与10min（117±17nmol/L）相比较，呈显著性差异(P＜0.05)。结论：通过Fura-2/AM可精确反映［Ca2+］i, SP兴奋AP细胞SPR后可通过Ca2+来完成其部分的生物学效应，说明了SP对生殖轴（下丘脑-垂体前叶-卵巢/睾丸）有调控作用。 【关键词】 P物质 Ca2+ 垂体前叶 Fura-2/AM 　　P物质（SP）通过垂体前叶（AP）的P物质受体（SPR）产生作用。作为第二信使的钙离子可调控细胞内许多生理功能，如肌肉收缩、凝血过程、AP、神经冲动、分泌功能等。但SP作用于AP细胞其［Ca2+］i是否有变化的研究却很少，尤其是SP对下丘脑-垂体-性腺轴的调控机理尚不十分清楚。Fura-2/AM是80年代发现的第二代荧光探针, 是目前被公认测量［Ca2+］i的一个良好指示剂，因此，本实验利用Fura-2/AM 对培养的大鼠 AP细胞的［Ca2+］i进行检测，探讨SP的作用机制。 　　 1 材料与方法 　　1.1 实验试剂 　　DMEM:美国GIBCO公司；胎牛血清：天津生物技术公司；1：250胰蛋白酶：美国Amresco公司；SP：美国Sigma公司；Fura-2/AM：美国Sigma公司；粉剂,用DMSO 溶解稀释成1mmol/ L , 储存于冰箱内备用。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 AP细胞培养 成年雌性大鼠24只，体重230～260g,于间情期清醒状态下断头，无菌取出AP，剪成碎块，加0.25% 胰酶消化25min，两次，过钢网，离心弃上清，加DMEM使细胞悬垂并分散，进行细胞计数，调整细胞密度至1×106个细胞/ml，制成细胞悬液，将悬液接种到24孔培养板中，1ml/孔，孵育48h。 　　1.2.2 加入SP 实验中设立：①组为空白对照组（3孔），每孔加入1ml KHB缓冲液。②组为SP组（15孔，3孔为一时间段组），每组加入1ml KHB和100nmol/L SP的混合液孵育，调整孵育时间为10min、20min、30min、40min、50min，以10min组为对照组。 　　1.2.3 Fura-2/AM 负载 各组孵育完毕后加入含5μmol/L Fura-2/AM，0.2 % 小牛血清的KHB缓冲液1ml温孵40min ，弃缓冲液，用KHB缓冲液冲洗2～3 次，置于自制浴槽中，在倒置显微镜下观察荧光强度。 　　1.2.4 ［Ca2+］i的测定 采用阳离子测定系统和软件分析系统, 测定加SP前后单个AP细胞内钙离子荧光强度的变化。激发光波长分别为340nm 和380nm，发射波长为505nm，由下列公式 计算 胞内［Ca2+］i ,［Ca2+］i = Kd×( Sf2/ Sb2 )×［(R - Rmin)/(Rmax - R)］。式中Kd生理条件下为224nmol/L；R 是实验观察到的荧光比值( F340/ F380)；Rmax 是胞内Fura-2/AM 全部为Ca2+饱和时的荧光比值, 通过加入钙离子释放剂Ionomycin 20μmol/L测得；Rmin为Fura-2/AM 完全游离，未与Ca2+结合时的荧光比值, 通过加入EGTA 20mmol/L 测得；Sf2/ Sb2则为Fura-2/AM 在无Ca2+以及与Ca2+结合达饱和状态时，Fura-2/AM 在380nm 处的荧光强度。细胞的自发荧光在没有负载Fura-2/AM 时测定，计算Ca2+浓度之前减去细胞自发荧光和背景荧光。 　　1.3 统计学处理 　　数据以均值±标准差（x±s ）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异显著性指标，P＜0.01为差异极显著性指标。 　　 2 结果 　　当SP浓度为100nmol/L，孵育时间为10min、20min、30min时，［Ca2+］i随着时间的增加而升高；而孵育时间增加到40min、50min时，［Ca2+］i呈现减少趋势。孵育时间为10min时［Ca2+］i为117±17