实时荧光PCR结合融解曲线分析快速鉴定临床常见曲霉菌.pdfVIP

.330. 中国真菌学杂志 2012 年 12 月第7 卷第6 期 Chin J Mvcol.December 2012 , Vol 7 , No. 6 ·论著· 实时荧光 PCR 结合融解曲线分析快速鉴定 临床常见曲霉菌 史俊艳郭莉娜徐英春王瑶王贺刘文静 (中国医学科学院北京协和医院，北京 100730) [摘要} 目的 采用实时荧光PCR 结合融解曲线分析的方法快速将临床常见曲霉菌鉴定到种的水平。方法 ①普通PCR 扩增真菌 ITS 区后进行序列比对，准确鉴定菌种并设计种特异性引物和探针。②采用实时荧光 PCR 的方法及融解曲线分 析，根据不同的解链温度将5 种临床常见曲霉菌鉴定到种的水平。③特异性、敏感性、重复性试验。结果 æ解链曲线分析 显示，不同种曲霉菌的种特异性探针有特异的 Tm 值，根据 Tm 值的不同可以将5 种曲霉菌区分开来:烟曲霉 Tm=61. 4 C， 黄曲霉Tm = 57. 4 C ，黑曲霉 Tm =67. 7 C ，土曲霉 Tm =55. 2C和 64. 5C ，构巢曲霉 Tm = 65.8 C。其中小于包根霉和疵状瓶 霉与烟曲霉探针发生交叉反应，阴性对照不出现特异性的解链曲线。②该方法对5 种曲霉菌的检测下限分别为:烟曲霉 56.8 龟，黄曲霉 1 110 毡，黑曲霉 13.7 毡，土曲霉 123 毡，构巢曲霉780 fg Tm 值波 ③重复性试验结果显示，同一种曲霉菌的 o 动范围不超过0.5 C。结论 采用实时荧光 PCR 结合融解曲线分析的方法可以快速准确地将临床常见曲霉菌鉴定到种的 水平，具有良好的敏感性、特异性和可重复性，有助于临床侵袭性曲霉感染的诊断和指导抗真菌药物使用。 [关键词] 实时荧光PCR; 曲霉菌:融解曲线 [申图分类号1 R379.6 [文献标识码1 A [文章编号1 1673-3827(2012)07-0330-05 Rapid identification of clinical important A再pergillus using real-time PCR combined with melting curve analysis SHI Jun-y归an叽1 ， GUO Li蜻吁咀na咀a ， XU Yin吨I咯g-chun ， 顶WANG Ya剖o ， WANG He ， 口LIU 矶Wen忏I卜-仙19 ( Chinese Academy ofMedical Sciences ,Clinical Microbiology Lαborαtory ， Peking Union Medical College Hospital ,Peking 100730) [ Abstract 1 Objective Real-time PCR combined with meltir吨I lmpo眈ant Aspergillus to the species level. Method ( 1) PCR amplification of fungal ITS region , and then sequence alignment were done to identificate Aspergillus isolates correctly and design species specfic primers and probes. (2) Five species of clinical impor- tant Aspergillus were identified to species level according to different melting temp