供者淋巴细胞输注治疗小鼠H22肝癌的实验研究.docVIP

　　供者淋巴细胞输注治疗小鼠H22肝癌的实验研究 作者：曾冬香，姜藻，毕延智，张琰 ［摘要］目的: 观察供者淋巴细胞输注（DLI）对小鼠H22肝癌的 治疗 作用。 方法 : 荷瘤昆明小鼠分荷瘤对照组（A组）、5.氟脲嘧啶（5.FU）化疗组（B组）、DLI组（C组）及5.FU加DLI组（D组）4组。比较各组小鼠生存期、抑瘤率及瘤体病理检查结果，检测NK细胞及IL.2的活性。 结果: B、C组生存时间长于A组（Plt;0.01），D组长于C组（Plt;0.01）;B、C、D各组抑瘤率依次为61.3%、34.7%、89.5%;C、D两组NK细胞及IL.2活性明显高于A、B组（Plt;0.05）;病理观察见C、D组大量炎性细胞浸润。 结论: DLI对小鼠H22肝癌有治疗作用，是一种潜在可行的实体瘤细胞过继免疫治疗方法。 　　［关键词］ 肝癌;供者淋巴细胞输注;移植物抗肿瘤效应;免疫治疗;小鼠 　　随着 现代 生物技术的 发展 ，生物治疗已逐渐成为治疗肿瘤的重要手段之一。 目前 LAK细胞、TIL细胞、TAK细胞等过继性细胞免疫疗法都是给患者回输其自身的淋巴细胞。本 研究 通过向荷瘤小鼠体内输注正常的供者淋巴细胞，诱导特有的异体抗肿瘤反应来攻击肿瘤，探索一种新的实体瘤过继免疫治疗方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 　　BALB.C小鼠、KM小鼠，雌性，均为8～10周龄，体重18～22g，由东南大学医学院实验动物中心提供。 　　1.2 试剂 　　环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）为江苏恒瑞医药股份有限公司产品;5.氟脲嘧啶（5.FU）为天津金耀氨基酸有限公司产品。 　　1.3 实体型荷瘤鼠模型建立 　　无菌操作取传代8d的H22小鼠腹水，台盼蓝染色，活瘤细胞超过90%，调细胞浓度为1×10 7 ml -1 ，分别取0.2ml接种于KM小鼠右侧腋下皮下，接种后第3天可触及肿瘤结节。 　　1.4 实验分组 　　共分4组，每组10只（另备3只中途处死）。A组（荷瘤对照组）:不作任何处理;B组（5.FU化疗组）:接种后第3天开始化疗，5.FU20mg#12539;kg -1 腹腔注射，连续用药7d;C组［供者淋巴细胞输注（donor lymphocyte in-fusion，DLI）组］:接种前11d经脾细胞加CP加供体脾细胞输注的方法［1］ 诱导对BALB.C小鼠的特异性免疫耐受状态，接种后第3、10、17天尾静脉注射供鼠BALB.C脾脏淋巴细胞，细胞数分别为0.5×10 7 、0.5×10 7 及1×10 7 只 -1 。D组（5.FU加DLI组）:接种前4d诱导免疫耐受，接种后第3天开始化疗，方案同B组，第10、17、24天予DLI，细胞数同C组。 　　1.5 观察指标 　　1.5.1 生存时间 记录接种当天开始至小鼠死亡的时间， 计算 各治疗组生命延长率。 　　1.5.2 抑瘤率 待瘤结节长出后每天用游标卡尺测量瘤体长短径，比较瘤体生长情况，计算接种后第15天各治疗组抑瘤率。肿瘤体积=长径×短径 2 .2;抑瘤率=（对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积）.对照组肿瘤体积×100%。 　　1.5.3 瘤体光镜下组织病 理学 观察 接种后第15天各组处死3只小鼠取瘤体，固定包埋切片，HE染色光镜观察。常规无菌取脾，制备脾细胞悬液以备检测。 　　1.5.4 NK细胞杀伤活性（NKCA）检测 参照 　　A、B、C、D各组NK细胞活性依次为16.9±2.8、35.9±3.1、78.4±5.5和47.3±3.7，正常小鼠为66.2±4.9。A组NK细胞活性较正常小鼠明显下降（Plt;0.05），B组与A组比较差异无显著性（Pgt;0.05），C组NK细胞活性达正常水平（与A组比较， Plt;0.05），D组与其余各组比较均有显著差异（均为Plt;0.05）。 　　2.4 IL.2的产生及其活性 　　A、B、C、D各组IL.2活性依次为0.258±0.260、0.218±0.016、0.325±0.044和0.393±0.028，正常小鼠为0.378±0.064。A组IL.2活性明显低于正常小鼠（Plt;0.05），B组与A组比较差异无显著性（Pgt;0.05），C、D两组IL.2活性达正常水平（与A组比较，均为Plt;0.05）。 　　2.5 光镜下瘤体组织病 理学 变化 　　光镜下各组肿瘤组织均有不同程度的出血、坏死，其中B组纤维化明显，C、D两组瘤组织大片坏死，瘤细胞变小，核固缩、变性，间质内有大量炎性细胞浸润（图1），以淋巴细胞及巨噬细胞多见，D组还可见大量增生的淋巴滤泡（图2）。 　　图1 C组瘤体光镜下组织病理学改变 ×100