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沉淀技术 - 资料中心 - 生物在线.ppt
图16-10表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。 等电点沉淀法 等电点沉淀法注意事项 本法适用于憎水性较强的蛋白质,例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。 但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶,则在低离子强度的溶液中,调 pH在等电点并不产生沉淀。 等电点沉淀法往往不能获得高的回收率,通常与其他沉淀方法结合使用: 在调节等电点时,如果采用盐 酸、氢氧化钠等强酸强碱,要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动,也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。 中性盐浓度增大时,等电点向偏酸方向移动,同时最低溶解度会有所增大。 有机溶剂沉淀法organic sovent precipitation 概念:在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂,降低溶质的溶解度,使其沉淀析出。 有机溶剂对于许多蛋白质(酶)、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用,是较早使用的沉淀方法之一。 优点:1)分辨能力比盐析法高,即蛋白阿质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀;2)沉淀不用脱盐,过滤较为容易; 缺点:1)对具有生物活性的大分子容易引起变性失活,2)操作要求在低温下进行。3)成本高 总体来说,蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。 有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀法机理 A 降低溶剂介电常数(介电常数D有机 D水) ,减小溶剂的极性,从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力,增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力,因相互吸引而聚合沉淀。 B 破坏水化膜:由于使用的有机溶剂与水互溶,它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子,破坏水化层,降低蛋白质分子的溶剂化能力,破坏蛋白质的水化层,使蛋白质沉淀。 C 相反力:疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层 有机溶剂沉淀法机理 降低介电常数 破坏水化膜 常用的有机溶剂沉析剂 选择依据: 水溶性要好 介电常数要小 致变性作用要小(甲醇) 毒性要小、挥发性适中 容易获取 沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂 乙醇:沉析作用强,挥发性适中,无毒,常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析; 丙酮:沉析作用更强,用量省,但毒性大,应用范围不广 1、温度使用有机溶剂沉淀时,操作必须在低温下进行 有机溶剂与水混合时,会放出大量的热量,使溶液的温度显著升高,从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用,有机溶剂要缓缓加入,防止溶液局部升温。 温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力,一般温度越低,沉淀越完全。 因此,所用的有机溶剂须预先冷却到-10--20℃;在使用有机溶剂沉淀生物高分子时,整个操作过程应在低温下进行 。 有机溶剂沉淀法的影响因素 2、pH值: pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。 3、样品浓度:样品较稀时,将增加有机溶剂投入量和损耗;样品太浓会增加共沉作用 。一般认为蛋白质的初浓度以0.5~2%为好,粘多糖则以1~2%较合适。 4、中性盐浓度:较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用,减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.01~0.05mol/L为好,常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。 5、某些金属离子:一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物,这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性,有利于沉淀形成,并降低溶剂用量。 有机溶剂沉淀法的影响因素 非离子型聚合物 用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶解度,有选择性的沉淀蛋白质。 机理:与有机溶剂相似,能降低水活度,破坏蛋白质的水化膜。 常用非离子性聚合物为Polyethylene glycol (PEG): 是一种水溶性的高分子聚合物,分子量 4,000 以上的 PEG 可以用来沉淀蛋白质。 优点: 1. 室温 2. 颗粒大,易于收集 3. 提高蛋白质的稳定性 4. PEG 难去除,幸而 PEG 通常一般不影响下一步的分离。 机理:架桥与静电 离子型多糖聚合物,酸性多糖羧甲基纤维素、海藻酸钠,食品蛋白的沉淀。 合成的离子聚合物: 聚丙烯酸(pH 2.8 90%蛋白沉淀) 聚苯乙烯季胺盐(pH 10.4, 95% 蛋白沉淀) 聚甲基丙烯酸 聚乙烯亚胺 聚电解质沉淀 成盐类复合物沉淀 此类沉析剂有以下三种: (1)高价金属盐:Cu2+,Ag2+,Zn2+,Ca2+与酸性基团结合; (2)苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等,与碱性基 团结合 (3)无机复合盐:磷钨酸盐、磷钼酸盐等 缺点:容易导致活性蛋白的不可逆变性,需采用较温和的条件,有时还需加入一定的稳定剂。 1) 金属离子沉淀 金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸残基中咪唑基结合,从而降低蛋
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