基因克隆及蛋.pptVIP

Northern印迹杂交 探针标记 提取RNA 探针片段变性 探针片段变性 RNA-甲醛凝较电泳 转膜并进行交联 预杂交 杂交 曝光 RNA变性（60oC,15min） * 进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 X-gal: (5-溴-4氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷) X-gal是E.Coli产生的β-半乳糖苷酶的显色底物。β-半乳糖苷酶可将X-gal转变为不溶性的深蓝色沉淀。 * 进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 双链pGEM-T质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段。 用质粒转化LacZ基因突变的大肠杆菌株（JM109或DH5α）时，因为由质粒表达的α-肽补充了大肠杆菌缺失的α-肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。 * 进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增 在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了α-肽的表达，因而在加入IPTG和X-gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。 * 质粒的提取及酶切鉴定 * * 第四部分：外源基因的原核表达 * 外源基因的原核表达 外源基因的表达是研究和探索基因功能、基因表达调控机制以及编码蛋白质的结构和功能的重要方法，亦是制备和生产新型蛋白质药物、新型诊断试剂必不可少的手段。外源基因通过在宿主细胞中的表达可大量获得其产物。 * 一、原核表达系统常用的载体及其应用 （一）大肠杆菌表达系统 （二）大肠杆菌载体的表达方式 * 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的经典表达系统。 优点： 遗传背景清晰、目的基因表达水平高、培养周期短等； * 大肠杆菌表达系统 缺点： ①缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工过程，如剪切、糖基化及正确二硫键的形成等； ②表达的蛋白质多以包含体形式存在，需经复性才能恢复构象与活性； ③宿主本身杂蛋白多，纯化步骤复杂。 * 大肠杆菌载体的表达方式 1．非融合性表达载体：此种载体表达的蛋白质与天然状态下存在的蛋白质在结构、功能和免疫源性等方面基本或完全一致。 * 大肠杆菌载体的表达方式 2．融合表达载体：分子量较小的蛋白质可采用这种载体进行表达。 优点： ①可增加mRNA和表达产物的稳定性； ②可应用针对融合蛋白中非目的蛋白片段 进行亲和层析，很容易将融合蛋白纯化； ③通过融合表达可产生可溶性蛋白； * 大肠杆菌载体的表达方式 融合表达载体主要有以下几种： ①谷胱甘肽-S-转移酶（GST）系统； ②β-半乳糖苷酶系统； ③麦芽糖结合蛋白（MBP）系统； ④蛋白A系统； ⑤与纯化标签融合表达以及其他融合系统。 * 大肠杆菌载体的表达方式 3．带纯化标签的表达载体：目前应用较多的纯化标签有GST-tag, FLAG-tag, His-tag. 4．分泌型表达载体 5．表面展示表达载体 6．带分子伴侣的表达载体? * 外源基因的原核表达载体构建及转化 * 扩增阳性克隆并进行诱导表达 pGEX-5x-1载体带有IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导启动子，可以表达外源蛋白的总量可以达到全菌蛋白的30%以上。 * SDS电泳 将含有目标蛋白的样品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）分离。利用浓缩胶和分离胶的浓缩效应，电荷效应和分子筛效应对不同分子量大小的蛋白质进行分离。 * * Western Blot GST-Pro-B GST * RNA提取纯化 RT-PCR 质粒DNA PCR 凝胶回收PCR扩增片段 目的基因片段T-A克隆 转化感受态细胞 蓝白斑筛选 质粒提取、酶切鉴定 连入GST融合表达载体 外源基因克隆到真核表达载体 GST融合蛋白表达 转化、活性测定 转染真核细胞 表达定位 得到目的基因片段的T-A克隆 * Northern印迹杂交是用于检测和量化细胞RNA的一种基本技术。它主要是将电泳凝胶中的RNA转移到尼龙膜上，通过紫外交联作用而使RNA与膜永久的结合在一起，固定在膜上的RNA样品与特异的探针杂交，从而对感兴趣的RNA进行定位。 Northern印迹杂交 * Northern印迹杂交 一、DNA探针标记 在核酸分子杂交中，探针是指用放射性核素或其他标记物标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够和待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的特定基因。 * Northern印迹杂交 一、DNA探针标记 用于探针标记的标记物有放射性核素与非放射性核素两大类，前者是目前最常用的标记方式；后者包括生物素、地高辛及荧光素等。 * Northern印迹杂交 一、DNA探针标记 核酸探