基因工程-第四章-目的基因的分离和合成.pptVIP

基因工程 楼士林 2002 （xm180-182） 基因工程 楼士林 2002 （xm182） hd176 hd176 基因工程 楼士林 2002 （xm180-182） Hd178 180 Hd178 180 xm205 Hd178 180 Xmp314-317 二抗：第二抗体，抗第一抗体种特异性抗原决定基的抗体 Xmp211 fig4－20 hdp195 * 苏州科技学院生物系 叶亚新 四、基因的化学合成 DNA的化学 DNA合成仪 酶促法 全片段酶促连接法 酶促填充法 合成目的基因其中的一些片段，在这些相邻的片段的3‘端有一短的序列互补 复性形成模板 用klenow酶去填补互补片段间的单链区域 * * 苏州科技学院生物系 叶亚新 化学合成法的基本战略 全基因合成 上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7% * * 苏州科技学院生物系 叶亚新 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其 编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到 的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时 必须考虑下列问题： 生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间 探针内部不应出现可能的互补区域 * * 苏州科技学院生物系 叶亚新 化学合成的单元操作 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的 * * 苏州科技学院生物系 叶亚新 DNA化学合成的用途 合成天然基因 修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等 如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 * * 苏州科技学院生物系 叶亚新 目的基因的分离 目的基因的功能克隆 根据特异蛋白分离目的基因 基本过程： 分离特异蛋白，测定特异蛋白的氨基酸顺序，推测该蛋白的核苷酸序列，合成探针 分离特异蛋白，作为抗原制备抗体，筛选cDNA表达文库 * * 苏州科技学院生物系 叶亚新 目的基因的分离 目的基因的功能克隆 根据特异蛋白分离目的基因 注意事项： 合成的探针必须特异的识别目的基因，充分考虑遗传密码的简并性 利用抗体筛选目的基因时，应构建cDNA的表达文库 * * 苏州科技学院生物系 叶亚新 目的基因的分离 目的基因的功能克隆 功能互补法克隆基因 利用被克隆的DNA片断与寄主细胞的染色体DNA在功能上的互补性来进行目的基因的直接分离 酵母基因组 酶切 DNA片断 λ噬菌体载体 营养缺陷型菌株 ＋ 基本培养基 重组体 * * 苏州科技学院生物系 叶亚新 实例：基因组文库DNA → 转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→ 转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因 基因组文库DNA →转化E.coli（无纤维素酶活性）→ 转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈 →纤维素酶基因 优点：简便，快速，可靠，是首选方法。获得的基因一定是完整基因。 缺点：适用范围较窄。 必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。 * * 苏州科技学院生物系 叶亚新 1. 遗传互补法 1)??原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。 i. 营养缺陷型受体细胞+外源DNA → 转化细胞涂布在合成培养基上 → 原养型细胞生长 ii. 受体细胞（无某种表型）+ 外源DNA → 转化细胞涂布在特殊培养基上 → 具有